留蘭香薄荷離體快繁技術研究

吳雯雯， 陸 兵， 李文清， 邵元健

(南通科技職業學院，江蘇南通 226007)

留蘭香薄荷(MenthaspicataLinn)是一種多年生宿根草本植物，用途廣泛，全草可入藥，廣泛用于中醫藥領域，也是世界著名的香料植物，具有較高的藥用、食用和工業價值[1]。我國留蘭香主要種植在江蘇南通及安徽太和地區，目前品種混雜退化嚴重，其主要原因是隨著薄荷市場的低迷，農民種植薄荷的積極性越來越低，母本難以妥善保留。利用植物組織培養的方式，可以很好地實現種質資源的保存和規模化生產[2]。國內關于留蘭香組織培養的研究已經有一些，但不是很多，而且不同的研究，結果也不盡相同。柴明良以留蘭香玻璃苗為對象，對誘導愈傷組織再生正常植株的培養基條件進行了探索[3]。王小敏等以留蘭香莖尖為試驗材料，主要研究了外植體消毒、不定芽增殖和試管苗移栽生根的條件[4]。申順先等以留蘭香含頂芽幼嫩莖段為外植體，對芽誘導、增殖和生根進行了研究[5]。這些研究都為留蘭香薄荷的組織培養打下了良好的基礎。本試驗以露地栽培的留蘭香帶芽莖段為材料，對留蘭香離體快繁技術進行研究，旨在為留蘭香工廠化育苗和種質資源保存提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與材料

試驗于2015年7月至2016年2月在南通科技職業學院組培室進行。供試材料為留蘭香，引種于南通如皋客來花卉園藝場，現栽培于南通科技職業學院苗圃基地。

1.2 主要藥劑和儀器

藥劑：NaClO、HgCl2、乙醇、6-BA、NAA、MS、N5、B6等均由國藥集團化學試劑有限公司生產；組培抗菌劑(簡稱PPM)，購自北京西美杰科技有限公司。儀器：超凈工作臺、培養架、空調、冰箱、高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平、pH試紙、移液管、容量瓶、營養缽、濾紙、玻璃棒等。

2 試驗設計

2.1 初代培養

2.1.1 獲取外植體 本試驗選取露地栽培，生長旺盛的留蘭香莖段為外植體，葉片全部除去，頂芽和腋芽保留。用2%的洗衣粉溶液浸泡外植體并不斷攪拌，用刷子仔細刷新，自來水洗凈，紗布包好，在流水中淋洗2 h后，置于超凈工作臺上。

2.1.2 外植體消毒試驗 外植體置于消毒好的燒杯里，用75%的乙醇殺菌30 s，然后分別用消毒劑消毒(表1)，消毒后用無菌水沖洗5～10次。將消毒后的外植體接種到準備好的培養基上，每個處理設10次重復，每瓶接種4個外植體，10 d 后記錄萌動率、污染率和死亡率。培養溫度為(25±1) ℃，光照1 500～2 000 lx，濕度80%左右，光照12 h/d。

表1 不同消毒劑和不同消毒時間對消毒效果的影響

2.1.3 芽誘導試驗 待萌發的不定芽長到2～3 cm時，選取長勢較好的小苗，重新切成1 cm的莖段，轉接到培養基上，培養基設3種：(1)MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；(2)MS+0.1 mg/L NAA；(3)MS，分別加入30 g/L蔗糖、7 g/L瓊脂。每個處理設10次重復，每瓶接種4個莖段。21 d后觀察芽誘導率和分化率。

2.2 繼代培養

切取初代培養的無菌芽苗，切成1～2 cm的小段，分別接種于增殖培養基上。考察培養基、6-BA、NAA和蔗糖這4種因素對增殖培養的影響，采用L9(34)正交試驗設計[6]。每個處理接種10瓶，重復3次，21 d后觀察分化增殖情況和苗健壯度。

將培養1個月的增殖苗切割不同部位，即頂芽、距離頂芽的第1個莖段、距離頂芽的第2個莖段、距離頂芽的第3個莖段，不同植株相同部位的苗轉接至同一瓶中，每個部位作為1個處理，每個處理重復3次，21 d后觀察苗的株高、直徑和增殖系數。

2.3 生根培養

將增殖培養基中的有效生產苗取出，接種到生根培養基上，進行生根培養。基本培養基為1/2MS培養基，NAA設3個濃度(0.1、0.2、0.5 mg/L)，分別加入15 g/L蔗糖、7 g/L瓊脂。每個處理設3個重復，每個重復接種10株。30 d后觀察生根率和根的狀況。

2.4 結果統計及分析

污染率=污染外植體數/接種外植體數×100%；死亡率=死亡外植體數/接種外植體數×100%；萌動率=萌動外植體數/接種外植體數×100%；誘導率=有不定芽產生的外植體數/接種外植體數×100%；增殖系數=單個外植體再生形成的芽的平均數；生根率=生根外植體數/接種外植體數×100%。

3 結果與分析

3.1 初代培養試驗結果

3.1.1 不同消毒劑和不同消毒時間對消毒效果的影響 將消毒處理后的莖段接種在初代培養基上，7 d后，幼芽開始萌動(圖1)。研究發現，不同消毒劑和消毒時間的消毒效果不同。隨著消毒時間的延長，污染率呈下降趨勢，但是死亡率呈上升趨勢，萌動率在用消毒劑0.1% HgCl2+2滴PPM消毒10 min時出現最大值，為75%。可見，選取的留蘭香莖段，用75%乙醇殺菌30 s，然后用消毒劑0.1% HgCl2+2滴PPM 消毒10 min，表面消毒滅菌效果最好，用NaClO消毒效果最差。

3.1.2 不同激素濃度對芽誘導的影響 接種的莖段培養7 d后明顯萌發，21 d后頂芽生長達3～5 cm，底部有不定芽。芽誘導率基本都在80%以上，基本培養基MS適合不定芽生長，激素組合對芽誘導率影響不大。各種激素組合與濃度對分化產生了明顯的影響，處理3培養基中頂芽誘導出的平均不定芽數為4.7個，誘導效果最好，隨著激素濃度的增加，誘導的不定芽數反而降低(表2、圖2)。結果說明，處理3，即只用MS基本培養基，不添加激素，為初代培養的最優培養基。

表2 6-BA和NAA對芽誘導的影響

3.2 繼代培養試驗結果

3.2.1 不同培養基、激素和蔗糖組合對不定芽繼代增殖的影響 極差分析表明，4個因素對增殖系數產生影響由主到次的順序為基本培養基、6-BA、NAA、蔗糖(表3)，說明培養基種類對芽分化和生長起著關鍵作用，MS培養基效果最好，N5和B6培養基均不適合留蘭香芽增殖試驗。蔗糖濃度對增殖的影響最弱，但是蔗糖濃度過高，反而會抑制苗的生長。6-BA 影響芽的誘導，濃度提高，分化率也提高，但濃度過高，無根苗會瘦弱，健壯度降低，要經多次壯苗方能生根移栽，反而影響繁殖效率；若濃度太低，無根苗數量會大大減少。綜合增殖系數和苗健壯度，選擇MS為基本培養基，添加0.2 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+25 g/L蔗糖，分化出的組培苗較多較大，易壯苗生根(圖3)。

表3 不定芽增殖 L9(34)正交試驗配方組合試驗結果

注：“*”越多，表明苗越健壯。

3.2.2 不同部位對不定芽增殖的影響 研究發現，留蘭香不同的生長部位對增殖有很大的影響，靠近基部的部位，由于有了一定的木質化程度，因此增殖系數最低，而靠近頂芽的下面第1個莖段的分蘗程度不如距離頂芽的第2個莖段完全，而頂芽生長最好，是最有利于增殖的部位，同時也有利于工廠化大量生產(表4)。

表4 不同部位對不定芽增殖的影響

3.3 生根培養試驗結果

研究發現，留蘭香組培苗較易生根，在3種NAA濃度下，生根率都達到了100%。添加的NAA濃度為0.1 mg/L時，根粗壯，有較多的毛細根，這種根系吸收面積大，吸收能力強，移栽時成活率高(表5、圖4)。因此，適宜生根的NAA濃度為0.1 mg/L。

表5 NAA濃度對生根的影響

3.4 煉苗移栽

將生根狀態理想的組培苗連同培養容器從培養室取出，置于溫室大棚中，在自然光照下進行適應性鍛煉10 d，再打開瓶口2 d。煉苗后，將組培苗從瓶中小心取出，洗干凈黏附在根部的培養基，用0.1%的多菌靈1 000倍溶液浸根，然后移栽至已經高錳酸鉀消毒的基質中(沙子 ∶草炭土為1 ∶1)。注意保持水分供需平衡，防止雜菌孳生，一般移栽成活率可達到85%(圖5)。

4 討論與結論

本研究結果表明，初代培養的最佳條件為MS基本培養基+30 g/L蔗糖，不加激素，產生的不定芽數最多，誘導率也較高；繼代培養的最佳條件為MS+0.2 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+25 g/L蔗糖，選用頂芽部位進行增殖更有利于留蘭香最后的生根比例；生根培養的最佳條件為1/2MS+0.1 mg/L NAA+15 g/L蔗糖，通過此途徑長成的薄荷苗大多健壯，莖粗壯，葉片肥厚，容易生根。

試驗結果顯示，在組織培養整個過程中，留蘭香對6-BA和NAA的濃度需求都比較低，如果激素濃度稍高，反而會抑制試管苗的生長，同時會長出較多氣生根，這與王麗等的研究[7]一致。

本研究以留蘭香莖段為外植體進行薄荷離體快繁研究，因為留蘭香莖段上茸毛較多，腋芽與莖稈的交界處難以消毒干凈，所以在外植體消毒時，先用75%的乙醇消毒30 s，再用0.1% HgCl2+2滴PPM 消毒10 min，殺菌效果較好。PPM是美國Plant Cell Technology專門為植物組織培養而研發的高效抗菌試劑，目前還尚未有在薄荷外植體消毒中使用的報道。由于培育的苗還未進行成分分析，具體使用PPM后，對薄荷精油的品質是否有影響，還需進一步研究。

[1]張澤宏，王兵麗，陳巧玲. 薄荷組織和細胞培養的研究進展[J]. 漳州師范學院學報(自然科學版)，2013(3)：93-95.

[2]陳世昌. 植物組織培養[M]. 2版.北京：高等教育出版社，2015：227-230.

[3]柴明良. 留蘭香玻璃苗愈傷組織化再生正常植株[J]. 植物生理學通訊，1991，27(5)：371.

[4]王小敏，梁呈元，李維林. 留蘭香組織培養及快速繁殖條件的優化[J]. 植物資源與環境學報，2007，16(4)：38-42.

[5]申順先，李學慧，賀愛利，等. 留蘭香微繁技術體系研究[J]. 北方園藝，2013(13)：146-149.

[6]蓋鈞鎰. 試驗統計方法[M]. 北京：中國農業出版社，2000：285-290.

[7]王 莉. “草原”美國薄荷的組織培養及揮發油成份研究[D]. 雅安：四川農業大學，2008：43-45.