一株產幾丁質酶菌株的篩選鑒定與產酶條件優化

苗 飛，孟 陽，王 悅，袁春營，崔青曼

(天津科技大學 海洋與環境學院，天津市海洋資源與化學重點試驗室，天津 300457)

幾丁質廣泛存在于真菌、細菌、高等植物及甲殼動物等的外殼中，據估計自然界每年生物合成的幾丁質約為1×1011t，是自然界中第二豐富的多聚糖[1-3]。幾丁質及其降解產物作為重要的有機碳源和氮源參與生態系統的物質交換和能量流動[4]，同時作為一種新材料，已廣泛應用在化學、醫藥、食品、農業、環保等領域[5]。目前幾丁質的降解產物主要來自于化學方法的降解，但是該方法會引起較嚴重的環境污染，不符合綠色生產的需要。而幾丁質酶可催化水解幾丁質的β-1，4糖苷鍵，生成N-乙酰氨基葡萄糖，具有條件溫和、得率高且不污染環境等優點，因此在蟹、蝦殼等幾丁質廢物的轉化和利用方面具有廣闊的前景[6-8]。自然環境中存在大量幾丁質，其降解主要由微生物來完成，那么從自然界中分離篩選幾丁質酶產生菌株，無疑是一條較為有效的途徑，一些學者已從自然環境中分離出幾丁質酶產生菌株，并進行了條件優化、酶學性質及基因能克隆等研究[9-12]。此外，微生物產生的幾丁質酶還可用于生物防治上，趙秋敏等[13]從524株芽孢桿菌中篩選出一株幾丁質酶活力高的側孢芽孢桿菌(Bacilluslaterosporus)1.864菌株。研究表明，該菌對小麥赤霉菌等6種病原真菌具有明顯的抑制作用。通過幾丁質酶抑制劑以及酶活力變化對抑制真菌活性的相關研究，初步認為該菌株的抑菌物質為幾丁質酶。生物測定表明1.864的幾丁質酶粗酶對蚊幼具有較高的活性，同時對蘇云金桿菌(B.thuringiensis)制劑殺蟲活性具有明顯的增效作用。基于此，筆者從對蝦養殖底泥中分離并鑒定一株幾丁質酶產生菌株，并采用響應面法對該菌株的產酶條件進行了優化，為該菌株的進一利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

該菌株從天津漢沽對蝦養殖池底泥中分離得到。

1.1.2 主要材料

K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、FeSO4·7H2O、ZnSO4、NaNO3、NaCl、苯酚均為分析純；瓊脂(北京奧博星生物技術有限責任公司)；細粉幾丁質、GoldViewⅠ型核酸染色劑(北京索萊寶科技有限公司)；3，5-二硝基水楊酸(天津市光復精細化工研究所)；Taq DNA polymerase、dNTPs(大連寶生物工程有限公司)；普通DNA產物純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。

膠體幾丁質液體發酵培養基(%)：KH2PO40.03，K2HPO40.07，FeSO40.002，MgSO4·7H2O 0.05，ZnSO40.001，1%(m/V)膠體幾丁質1.5，pH 7.0。

膠體幾丁質固體篩選培養基：液體培養基基礎上添加1.6%瓊脂。

膠體幾丁質的制備參考文獻[14]的方法并略作修改:1 g幾丁質加入少量丙酮研磨至糊狀，加入40 mL濃鹽酸，使之充分溶解，經玻璃纖維棉過濾，得到的液體溶于5倍體積的50%乙醇溶液中，攪拌至出現膠體懸浮物，反復離心、蒸餾水洗滌直至中性，配制含量為1%(m/V)后，冰箱中4 ℃保存。

1.1.3 主要儀器

立式雙層小容量恒溫培養搖床(上海新苗醫療器械制造有限公司)，全溫型多振幅軌道搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)，立式蒸汽滅菌器(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)，智能型垂直流超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)，高速冷凍離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)，生物顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司)，精密pH計(天津市盛邦科學儀器技術公司)，CO2培養箱(Thermo Scienrific有限公司)，電子分析天平(上海奧豪斯儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 幾丁質酶產生菌株的篩選

平板篩選法，參考文獻[15]的方法進行。取少量底泥加入適量無菌水重懸，上清液梯度稀釋后涂布于膠體幾丁質平板上，30 ℃培養3～5 d，觀察在菌落周圍是否產生透明圈，挑選透明圈直徑較大的菌株，經多次劃線純化后，將初篩菌株接入膠體幾丁質液體發酵培養基，測定幾丁質酶活力，選取酶活力最高的菌株WY作為試驗菌株。

1.2.2 幾丁質酶活力的測定

[16]的方法并加以改進。取發酵液3 mL，8000 r/min離心15 min后，取上清液1 mL與1%膠體幾丁質1 mL混合，40 ℃反應30 min，取出加入1.5 mL蒸餾水與1.5 mL DNS溶液，混勻，沸水浴5 min后，流水冷卻至室溫，定容至25 mL，于540 nm處測吸光值，以滅活的酶液作為空白對照。

酶活力單位定義：在上述條件下每分鐘產生相當于1 μg N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量，定義為一個酶活力單位(U)。

1.2.3 菌株的鑒定

1.2.3.1 菌株的形態學研究

菌株純化后接種膠體幾丁質篩選培養基，30 ℃恒溫培養3 d后觀察菌落形態；革蘭氏染色后于普通光學顯微鏡下觀察菌體形態；掃描電鏡下觀察菌體形態。

1.2.3.2 16S rDNA序列分析

細菌總DNA的提取使用試劑盒法。PCR擴增采用16S rDNA通用引物：27 F和1495 R。反應體系(50 μL)為：10×Buffer：5 μL；dNTPs：4 μL；27F：1 μL；1492R：1 μL；Taq酶：0.5 μL；DNA模板：2 μL；蒸餾水：36.5 μL。擴增程序：預變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；30個循環；72 ℃維持10 min。PCR產物由北京奧科生物公司進行測序，將所得序列提交GenBank數據庫并進行BLAST分析比對。

1.2.4 響應面法優化菌株的產酶條件

在單因素試驗的基礎上，根據 Box-Benhken的中心組合試驗設計原理，采用響應面法在3因素3水平上對菌株的產酶條件進行優化，試驗因子和水平見表1。

表1 試驗因素和水平編碼值

注：A，培養時間；B，培養溫度；C，膠體幾丁質含量.下表同.

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

用膠體幾丁質為唯一碳源的篩選培養基和透明圈法篩選出產幾丁質酶的11個菌株，純化后測定這些菌株的產酶活力，結合其透明圈直徑與菌株直徑的比值大小，選取一株比值為2.89、幾丁質酶活力7.5 U/mL的菌株WY作為試驗菌株。

試驗菌株WY在30 ℃膠體幾丁質固體篩選培養基上培養1 d后呈乳白色凸起的圓形菌落，光滑，濕潤，培養3 d后出現透明圈，菌株和透明圈不斷擴大。

光學顯微鏡觀察，試驗菌株WY革蘭氏染色陽性；掃描電鏡觀察，菌株呈短桿狀，大小(0.4～0.8) μm×(1.5～2.5) μm；表面粗糙，呈單個或不規則群狀出現。

試劑盒提取菌株WY的DNA，16S rDNA通用引物進行PCR擴增，擴增產物的瓊脂糖電泳圖譜見圖2。對PCR產物進行測序，將所得序列輸入GenBank中，相似性較高的16S rDNA序列均來自芽孢桿菌屬，同已知的蜂房芽孢桿菌(Paenibacillusalvei)DSM29 16S rDNA序列相似性超過99%。利用MEGA軟件，以鄰接法繪制16S rDNA系統發育樹(圖3)。結合以上菌株WY的菌落形態、亞顯微形態特征和16S rDNA序列分析，確定篩選到的菌株WY為蜂房芽孢桿菌。

圖1 掃描電鏡照片(×9000倍)

2.2 菌株的產酶條件優化

2.2.1 響應面法的結果與分析

以培養時間(A)、培養溫度(B)、膠體幾丁質含量(C)為自變量，以幾丁質酶活力(Y)為響應值，試驗方案及結果見表2。

運用 Design expert 7.0軟件對上述結果進行整理和數據分析，二次回歸模型進行擬合，回歸分析結果見表3、表4。

圖2 菌株WY的16SrDNA電泳圖譜

圖3 基于16S rDNA序列同源性的菌株WY的系統發育樹

表2 響應面試驗方案及結果

表3 二次響應面回歸模型的方差分析

回歸模型的方差分析顯示(表3)，P<0.05，即表示該項指標顯著，模型的P=0.0001，說明該模型顯著; 一次項中培養溫度、膠體幾丁質含量的P值分別為0.0332和0.0165，說明培養溫度、膠體幾丁質含量對響應值的影響顯著；二次項A2、B2、C2的P值分別為<0.0001、<0.0001、0.0002，均小于0.05，說明所選3個因素的二次項對響應值影響顯著。F值越大，P值越小，說明該系數越重要。由此可見，在所選的各因素中，對幾丁質酶活力的影響依次為培養時間>培養溫度>膠體幾丁質含量。

表4 回歸模型的可信度分析

回歸模型的復相關系數為0.9915，校正相關系數為0.9762，達到了較好水平，說明模型的預測值和試驗值擬合較好，Y的變異系數較低，說明試驗的可靠性較高。信號與噪音的比率較大，說明這個模型能合適地反映試驗結果(表4)。因此，可以利用該回歸模型確定最佳產酶條件。最終擬合得到的二次回歸方程為：

Y=12.90+0.19A+0.39B+0.47C+0.03AB-0.055AC+0.11BC-3.66A2-2.61B2-2.00C2

響應面回歸分析和回歸方程擬合，繪出響應面分析圖，見圖4～6。

由圖4可見，隨著培養時間和膠體幾丁質含量的提高，產酶活力也在增大，當培養時間和膠體幾丁質含量升高到一定程度時，產酶活力達到最大，培養時間和膠體幾丁質含量繼續升高時，產酶活力又會隨之下降，說明它們取某個適中值時，可使產酶活力達到最大。同理，圖5和圖6也存在類似的規律。

通過軟件優化、模擬得最佳產酶條件為:培養時間為3.03 d、培養溫度為40.77 ℃、膠體幾丁質含量為1.62%，預測酶活力為12.95 U/mL。經3次驗證試驗，實際酶活力為12.99 U/mL。

考慮到操作的便利，將產酶條件修改為：培養時間為3 d、培養溫度為40 ℃、膠體幾丁質含量為1.62 %，在此條件下進行驗證，酶活力為13.07 U/mL。驗證試驗和修正試驗所得酶活力與理論值相差很小，說明利用響應面法優化得到的產酶條件參數準確可靠，模型具有較高的應用價值。

圖4 培養時間與膠體幾丁質含量對產酶活力的影響

圖5 培養時間與培養溫度對產酶活力的影響

圖6 培養溫度與膠體幾丁質含量對產酶活力的影響

3 討 論

在自然界，不同類群的微生物能在多種不同的環境中生長繁殖，從環境中吸收營養，并將廢物排出，對于環境的變化還能做出很好的適應。薛永常等[17]從大連海域海泥中篩選出1株產幾丁質酶海洋細菌，經鑒定為芽孢桿菌屬細菌；王曉輝等[18-19]從大連渤海灣的底泥樣品中分離到1株高產低溫幾丁質酶的海洋細菌，鑒定為交替假單胞菌(Pseudoalteromonas)，并進行了產酶條件的優化。

一些學者同時研究了幾丁質酶產生菌株的生防作用。從草坪土壤中篩選出產幾丁酶的放線菌，經過鑒定，確定為皺孢鏈霉菌(Streptomycesscabrisporus)，對4種草坪草根腐病菌的抑制作用進行了探討[20]；徐大可等[21]從篤斯越橘的根部獲得1株對12種受試病原真菌都具有拮抗活性的內生細菌DUT菌株，該菌株對菜豆炭疽病病原真菌(Colletotrichumlindemuthianum)抑菌率達70.5%，對2種越橘葉斑病病原菌擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsissp.)和柯氏帚梗柱孢霉(Cylindrocladiumcolhounii)的抑制率分別達68.6%和57.7%。通過對其形態特征觀察、生理生化特性鑒定及16S rDNA序列同源性分析，鑒定該細菌為粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，對DUT菌培養特性研究結果表明，該菌培養8 h可達對數生長期，最適生長pH值為7.5，最適生長溫度為28～30 ℃，利用雙抗生素標記的DUT菌株回接越橘，該菌株可在越橘體內定殖，DUT菌能夠產生幾丁質酶，發酵36 h后粗酶液的酶活力可達20.11 U/mL。鄭志成等[22]從廈門地區牡蠣養殖場灘涂分離篩選到1株產生幾丁質酶的蜂房芽孢桿菌B-91，并研究了幾丁質酶的產酶條件。以蜂房芽孢桿菌B-91為主要成分，開發了錨頭鳋(Lernaea)橈足類特效殺蟲劑，對魚體寄生的中華鳋(Sinergasilus)、錨頭鳋、魚鲺(Argulus)、車輪蟲(Trichodina)及水體中水蛛、紅蟲等浮游動物枝角類、橈足類具有極強的毒殺作用，而對池內飼養的魚類貝類等特種水產品種無不良影響。

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的變態和生長發育總是伴隨幼體的不斷蛻皮和幼蝦的不斷蛻殼進行的。蛻殼(皮)是對蝦生長發育的結果，當機體組織生長及營養物質累積到一定程度時必然要進行蛻殼(皮)。正常情況下，每蛻殼(皮)一次，蝦體會明顯增長，對蝦一生中要蛻殼50余次。對蝦蛻下的殼除部分被對蝦攝食外，其余均沉降在池底，由微生物降解后參與池塘的物質循環。據此，推測池塘底泥中存在著幾丁質酶產生菌株，用于降解對蝦殼質。本研究從養蝦池塘的底泥中篩選幾丁質酶產生菌株，根據菌株和菌落的形態以及16S rDNA序列分析，鑒定為蜂房芽孢桿菌，并優化了其產酶條件。下一步擬進行分離菌株對小型甲殼動物(枝角類、橈足類等)的防治效應研究，還要進行分離菌株對凡納濱對蝦的安全性研究，以此開發對蝦專用微生態制劑，確保對蝦養殖的健康持續發展。

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