應用Illumina高通量測序技術分析中華真地鱉腸道微生物多樣性

馮飛斐， 王一丁

(四川師范大學生命科學學院，四川成都 610100)

中華真地鱉(EupolyphagesinensisWalker)，中藥名土鱉蟲，別稱土元、地鱉蟲、地烏龜、簸箕蟲等，為蜚蠊目鱉蠊科地鱉亞科地鱉屬昆蟲。中華真地鱉雌蟲干燥體是一種傳統中藥，是《中華人民共和國藥典》中記載的正品藥材。中華真地鱉的藥用歷史悠久，成書于漢代我國第一部藥物著作《神農本草經》、東漢著名醫學家張仲景的《金匱要略》以及明代李時珍的《本草綱目》等幾乎所有著名藥典都對其有明確的記載[1]。中華真地鱉腸具有破血逐淤、續筋接骨的功能，被廣泛應用于中藥處方中。現代藥理學的研究表明，中華真地鱉對心腦血管系統有保健作用，能降脂調脂、抗凝血、抗血栓等，還具有抗腫瘤、抗氧化作用，此外還具有促進骨折愈合、鎮痛、增強人體免疫等功效[2]。還有研究發現，中華真地鱉營養豐富，部分地區已把它加工成食品[3]。

最初，中華真地鱉主要靠野生藥源滿足市場，近年來，由于化肥、農藥的大量使用，使其自然生存環境遭到破壞，野生藥源日益枯竭，遠遠滿足不了國內市場和出口創匯的需要[4]，而人工飼養地鱉蟲，不需要特殊設備，可因陋就簡，投資少[5]。因此，人工飼養中華真地鱉很快成為各地開展經營的項目。到目前為止，我國中華真地鱉規模化養殖已有三十多年歷史[6]。在影響中華真地鱉生命活動的各種不同因素中，人們對溫度、濕度、光照度、食物等外界因素的關注較多，但對中華真地鱉腸道微生物的研究與闡述較少。昆蟲腸道系統是隨著取食、消化、排泄等活動而多變的環境，其中寄居的微生物與昆蟲的營養生理活動有著密切的關系，一方面其群落結構、代謝活動受到昆蟲腸道微環境的影響，另一方面它們也影響著昆蟲的生命活動[7]。近年來，對一些重要昆蟲的腸道微生物的研究日漸活躍。同為蜚蠊目的美洲大蠊、德國小蠊作為對人類危害較大的害蟲，其腸道微生物也受到了研究人員的關注[8-9]。目前，中華真地鱉產業開發正在不斷深入。為了深入研究中華真地鱉的營養生理狀況，人為控制或改良中華真地鱉腸道微生態環境，開發中華真地鱉腸道微生物資源，研制微生態制劑，降低中華真地鱉人工繁育生產成本，筆者對中華真地鱉的腸道細菌進行了初步研究。

本研究采用基于Illumina Hiseq 2500平臺的第二代測序技術對中華真地鱉腸道微生物種類組成進行分析，該方法相較于傳統分析技術能夠產生覆蓋深度更大的數據量，檢測到純培養和傳統非培養技術未能發現的低豐度腸道微生物種類。

1 材料與方法

1.1 蟲源

雌性中華真地鱉成蟲，購于山東省臨沂市蒙山中華真地鱉養殖中心。

1.2 樣品消毒

取3頭健康的中華真地鱉雌性成蟲，用無菌水沖洗干凈后用75%乙醇浸泡3 min，再用無菌水沖洗3次，然后在蠟盤中進行無菌解剖，去除殘留脂肪體后，取出其腸道內容物備用。

1.3 腸道總DNA的提取

使用TIANamp Stool DNA Kit提取中華真地鱉腸道內容物總DNA，將提取出來的DNA樣品放在-70 ℃冰箱中保存。

1.4 16S rDNA-V4區的PCR擴增

以中華真地鱉腸道內容物總DNA為模板，使用16S rDNA-V4區特異引物515F(5′-GTGCCAGCMCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，及TIANGEN 2×TaqPCR Master Mix進行PCR。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

1.5 文庫構建和測序

確定PCR產物濃度達到上機檢測標準后。將3個樣品送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司測序。先分別用帶不同條碼(bar-code)的16S rDNA-V4區特異引物515F、806R進行PCR擴增，以區分樣品。產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后，用Qiagen Gel Extraction Kit回收目的條帶，再進行文庫構建。文庫構建采用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit，質控合格后上機測序，測序平臺為Illumina Hiseq 2500。

1.6 生物信息學分析

原始數據經FLASH軟件拼接，QIIME軟件過濾，UCHIME Algorithm軟件去除嵌合體后得到有效數據[10-12]。再用UPARSE軟件對有效數據在97%水平上進行操作分類單元(operational taxonomic unit，簡稱OTU)聚類，并用基于GreenGene數據庫的RDP Classifier分類工具進行物種注釋[13-14]。用QIIME軟件計算每個樣品的Alpha多樣性。

2 結果與分析

2.1 序列數與OTU數量統計

3個樣本 Y1、Y2、Y3中的原始數據經過分析處理，剔除蟑螂桿狀體屬(Blattabacterium)序列后，分別得到67 831、70 231、42 050條有效序列。對3個樣本進行數據標準化(data normalization)后，每個樣本均含42 050條有效序列，為統計方便，此后提到的有效序列均為標準化后的數據。按照16S rDNA相似性≥97%為一個OTU分類單元，Y1、Y2、Y3這3個樣本分別含有1 765、1 852、1 602個OTU，其中1 437個OTU在3個樣本中都有發現。

2.2 腸道菌群的α多樣性

如圖1所示，3個樣本的稀釋曲線斜率隨著測序通量的增大而逐漸降低，趨于平坦。采用Shannon、Simpson 、Chao1、ACE等指數來表示樣品中微生物的α多樣性，如表1所示，3個樣本的覆蓋率(Good’s coverage)都較高，達到了99.0%～99.7%。以上結果說明，測序數據量合理，樣本中的絕大多數菌都被檢出。3個樣本的α多樣性隨個體的不同而有所變化。

表1 3份中華真地鱉腸道內容物樣本的多樣性指數統計結果

2.3 中華真地鱉腸道菌群結構

2.3.1 門水平下的中華真地鱉腸道菌群結構 Y1、Y2、Y3這3個樣本的有效序列分別有98.7%、89.5%、98.8%能夠注釋到門水平，共檢測到31個菌門。數據標準化后相對豐度平均值排名前10的菌門見表2，可見其中相對豐度最高的是擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，它們的相對豐度平均值均超過10%，是中華真地鱉腸道中的優勢菌門。剩下的21個菌門中，Hydrogenedentes、CKC4只在2個樣本中被檢出，酸桿菌門(Acidobacteria)、Candidate division SR1、熱微菌門(Thermomicrobia)、Omnitrophica只在1個樣本中被檢出。樣品中鑒定出來的菌群數量，自綱水平起都較多，因此選擇在門水平作聚類分析，如圖2所示。關于樣品中各菌門含量的浮動是否與不同菌群之間的相互作用有關，有待進一步研究。

表2 3份樣本中相對豐度平均值前10的菌門

2.3.2 屬水平下中華真地鱉腸道菌群結構 Y1、Y2、Y3這3個樣本的全部有效序列分別有36.0%、40.6%、42.1%能注釋到屬水平，大部分有效序列不能在數據庫中進行屬水平對應分類，說明中華真地鱉腸道內有許多待開發的新菌屬。3個樣本中共檢測到309個菌屬，其中223個菌屬為3個樣本所共有的，52個菌屬在2個樣本中被檢出，34個菌屬只在1個樣本中被檢出。數據標準化后相對豐度平均值前15的菌屬見表3，其中Parabacteroides、Alistipes、沙雷氏菌屬(Serratia)、ChristensenellaceaeR-7group、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、CandidatusSymbiothrix、Clostridiumsensustricto1這7個菌屬的相對豐度平均值大于1%，可看作中華真地鱉腸道內的優勢菌屬。

表3 3份樣本中相對豐度平均值前15的菌屬

3 討論

近年來，Illumina測序技術開始應用于腸道微生物多樣性的研究。該測序技術利用基于單分子簇的邊合成邊測序技術(sequencing by synthesis，簡稱SBS)和專有的可逆終止化學反應，可以在短時間內獲得大量數據[15]。相較于分離培養方法和傳統分子生物學方法，該技術有重大突破。分離培養方法分析的微生物只限于那些能夠在人工培養基上生長的微生物，而能通過傳統的分離培養方法鑒定的微生物只占全部微生物的1%～10%[16]。因此通過傳統培養方法得到的結果并不能真實反映腸道菌群多樣性，這就使得用分離培養方法在研究腸道菌群的種群結構與多樣性方面受到了極大的限制。

與第一代測序技術相比，高通量測序技術通量更大，并且成本相對較低[17-18]。Illumina Hiseq 2500平臺能在27 h內生成相當于人類基因組40倍覆蓋率的數據[19]。與常用來分析微生物多樣性的變性梯度凝膠電泳(DGGE)相比，高通量測序技術靈敏度更高[20]。高通量測序技術有完美的定量功能，不但能夠測出某DNA屬于哪個物種，還能統計出該DNA在測序的過程中被測的次數，即被測樣品中該物種的數量，能夠直接反映某種DNA的豐度[21]。

本研究發現，中華真地鱉腸道中相對豐度最高的菌屬是Parabacteroides和Alistipes，這2個屬的細菌在人類腸道中均有發現。腸易激惹綜合征和潰瘍性腸炎患者腸道內的Parabacteroides菌屬含量較健康人體低，推測人體腸道內缺乏Parabacteroides屬細菌可能會導致以上2種病癥的發生[22]。與健康人相比，自閉癥患者腸道中Alistipes菌屬的含量較低，目前導致這種情況的原因尚不明確[23]。而通過攝取動物性食品則可讓人體腸道中Alistipes菌屬的含量上升[24]。除Parabacteroides和Alistipes這2個菌屬外，中華真地鱉腸道中還有沙雷氏菌屬等其他5個菌屬的細菌含量較高，這些細菌與中華真地鱉之間的關系，有待于進一步研究。

人類腸道微生物是宿主生理系統的一部分，可將其比喻為微生物組織，對于昆蟲而言，腸道微生物也十分重要，昆蟲腸道微生物有幫助宿主消化食物，為宿主提供食物中缺乏的必需營養素，提高宿主抗病性，從而影響宿主生理和發育等作用[25-26]。在本研究的基礎上進一步了解腸道內各微生物對中華真地鱉的作用，以及它們與宿主和環境之間的關系后，就可以以此為基礎開發微生態制劑。微生態制劑是采用有益微生物及其代謝產物和生長促進物質制成的活菌制劑，無毒副作用、無殘留、不產生抗藥性[27]。

國內對中華真地鱉的研究主要集中于有效成分的分離和藥用價值的研究。雖然我國已有多年中華真地鱉飼養歷史，但對養殖技術的深入研究較少。目前針對中華真地鱉腸病原菌引起的病害，一般以預防為主，對于已經出現的病害，則采用施用廣譜抗生素的手段治理[28]。在飼料中添加抗生素，若超時超量，可能會對人類健康造成危害[29]。早在2006年，歐盟各國已全面禁止抗生素作為動物飼料添加劑，而微生態制劑作為一種新型的生物制劑是較理想的替代品[30]。如果研發出適用的微生態制劑，則能夠促進我國中華真地鱉產業的大發展，市場前景十分樂觀。

4 結論

本研究首次應用Illumina HiSeq高通量測序技術初步分析了中華真地鱉腸道菌群多樣性，共檢測到了31個菌門，優勢菌門是擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門；共檢測到309個菌屬，優勢菌屬是Parabacteroides、Alistipes、沙雷氏菌屬、ChristensenellaceaeR-7group、乳酸桿菌屬、CandidatusSymbiothrix、Clostridiumsensustricto1這7個。本試驗結果為今后分析中華真地鱉生理生化特性、發展新型中華真地鱉養殖技術、研發適用于中華真地鱉的微生態制劑、開發中華真地鱉腸道微生物資源提供了理論基礎。

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