偽結核棒狀桿菌的分離鑒定及病原性研究

李基棕， 李文良， 毛 立， 郝 飛， 楊蕾蕾， 張紋紋， 江杰元

(江蘇省農業科學院獸醫研究所/農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室/國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇南京 210014)

羊偽結核(pseudotuberculosis)又稱干酪性淋巴結炎(caseous lymphadenitis)，是由偽結核棒狀桿菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis)引起的一種人獸共患慢性傳染病[1]。該病主要多發于山羊和綿羊，但也可感染駱駝、馬、牛和兔等多種動物[2]。病原體可通過破損的皮膚、污染的飼料及破潰的膿汁在羊群中直接接觸傳播，發病羊體溫升高、食欲減退、生產性能下降、皮下及淋巴結出現化膿性病變，呈膿性干酪樣壞死，孕畜出現死胎、畸胎，嚴重者導致死亡[3]。由于該病發病較慢，致死率不高，常被人們忽視。然而病原菌一旦入侵畜群，將很難被清除，常給養殖戶帶來較大的經濟損失，因此被農業部列為三類動物疫病[4]。安徽省某羊場發病羊皮下和周邊淋巴結出現局灶性膿腫，患病羊精神食欲較差、消瘦、被毛粗亂。切開腫塊，流出或可擠出黃白色膿汁，本研究從膿汁中分離鑒定1株偽結核棒狀桿菌，同時進行了耐藥譜分析和致病性研究，以期為該病的防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

綿羊鮮血瓊脂培養基、微量生化反應管、抗菌藥物藥敏紙

片均購自浙江杭州微生物試劑公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker等均購自北京全氏金生物技術有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 試驗動物

6～8周齡BALB/c小鼠購自揚州大學比較醫學中心；4月齡左右山羊購自無偽結核棒狀桿菌感染羊場。

1.3 病原的分離

將無菌采集的膿汁接種于鮮血瓊脂平板上，培養24 h后，挑取單個菌落進行純化。并將純化的菌落涂片進行革蘭氏染色鏡檢。

1.4 生化試驗

選取純化的菌落，分別接種于葡萄糖、果糖、麥芽糖、硫化氫等生化鑒定管中，置于37 ℃恒溫培養箱中培養，觀察其生化特性。

1.5 PCR鑒定

參照?etinkaya等設計的偽結核棒狀桿菌16S rRNA引物(P1：5′-ACCGCACTTTAGTGTGTGTG-3′；5′-P2：TCTCTAC GCCGATCTTGTAT-3′)[5]進行PCR擴增，預期擴增片段大小為816 bp。以純培養細菌的染色體DNA為模板，PCR反應體系為25 μL：TaqDNA聚合酶0.5 μL，DNA模板2 μL，引物P1、P2各1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 1 μL，無菌水17 μL。反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min。反應結束后取PCR產物于1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測。將目的片段切膠回收，并與pMD18-T載體連接，轉化DH5α感受態細胞，經鑒定正確后送江蘇南京金斯瑞生物技術有限公司測序。

1.6 耐藥性試驗

采用紙片擴散法進行藥敏試驗，將分離的偽結核棒狀桿菌均勻涂布于鮮血瓊脂平板上，然后將藥敏紙片緊貼于瓊脂表面，37 ℃培養24 h，測量抑菌圈直徑。

1.7 人工感染試驗

1.7.1 小鼠致病力試驗 將分離純化的菌株接種于含犢牛血清的LB液體培養基中，37 ℃培養24 h，取菌液10倍系列稀釋，進行活菌平板計數。取小鼠40只，隨機分為8組，1～5組小鼠進行腹腔注射，每只0.2 mL菌液(109、108、107、106、105CFU/mL)，6～7組小鼠進行皮下注射，每只0.2 mL菌液(109、108CFU/mL)，測定其致病性，對照組注射等量的培養基。對死亡小鼠進行剖檢，觀察組織病變，同時采集肺、脾、肝進行細菌分離培養。

1.7.2 山羊致病力試驗 另取10只健康山羊，隨機分成5組，每組2只，分別頸部皮下注射108、106、104、103CFU/mL菌液，每只2.0 mL，對照組注射等量的培養基。接種后每天測量體溫，觀察臨床癥狀并記錄結果，連續觀察21 d。

1.8 組織病理學觀察

將皮下接種的小鼠和山羊剖檢后進行病理學檢查，采集注射部位的皮膚、肌肉及周邊淋巴結固定于10%福爾馬林中。樣品固定后進行常規脫水，石蠟包埋，連續切片，HE染色后鏡檢觀察。

2 結果與分析

2.1 發病情況及臨床癥狀

該養殖場的83只羊中，有9只發病，發病率達10.84%。發病羊的頭頸部、腹部、四肢或肩前淋巴結處出現大小不等的膿腫，觸之有波動感，隨著時間延長，膿腫逐漸增大，最后形成膿胞。切開膿胞，膿汁呈牙膏狀，白色至灰白色。發病羊同時出現體溫升高、精神沉郁、食欲減退、體質量下降等癥狀。

2.2 細菌的分離培養

病原菌在綿羊鮮血瓊脂平板上培養24 h后，形成圓形、不透明、干燥、松脆、瓷白色、不溶血的小菌落。革蘭氏染色呈陽性小球桿菌(圖1)。

2.3 生化鑒定

該菌可發酵葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖，不發酵乳糖、木糖、甘露醇，不產生硫化氫，硝酸鹽還原陰性，符合偽結核棒狀桿菌生化特性。

2.4 PCR鑒定

將PCR產物在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，得到大小約800 bp的特異性條帶，與預期結果一致(圖2)。經測序分析，該片段大小為816 bp；經BLAST比對分析發現，與GenBank中收錄的CP003212、CP003217、CP0131146、CP013327、CP013697、CP013698、CP013699、BX248356、BX248357、BX248359、BX248360、NR037079、NR103937、NR117209、EU352542、GQ087586等偽結核棒狀桿菌的16S rRNA同源性高達99.0%以上，進一步確定該分離株為偽結核棒狀桿菌。進化樹分析發現，該毒株與CP0131146、CP013697、CP013698、CP013699、CP013327親緣關系最近，共同組成一組微小分支(圖3)。

2.5 藥敏試驗

分離的菌株進行藥敏試驗，結果表明該細菌對青霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星和氟苯尼考敏感；對新霉素、慶大霉素、氨芐西林、恩諾沙星、頭孢噻肟和紅霉素中度敏感；對鏈霉素、丁胺卡那霉素、環丙沙星、林可霉素和大觀霉素耐藥(表1)。

2.6 致病性試驗

2.6.1 小鼠致病性試驗結果 不同劑量細菌腹腔接種小鼠，5 h后0.2×109、0.2×108CFU/mL劑量組小鼠均有不同程度發病，10 h后除0.2×105CFU/mL劑量組均出現死亡，剖檢可見肝臟和脾臟膿腫，對照組小鼠未見異常(表2)，該分離菌對6～8周齡BALB/c小鼠的LD50為1×10-6.0CFU/mL。如圖4-A、圖4-B可見，皮下注射小鼠在接種部位出現大小不等的膿腫；如圖4-C可見，剖檢接種部位化膿，腎臟表面有多個化膿灶。

2.6.2 山羊致病性試驗結果 2×108CFU/mL攻毒組山羊在感染2 d起出現精神沉郁、采食量減少等癥狀，體溫持續升高3 d以上(40.1～40.9 ℃)。感染3 d，注射部位腫脹明顯，

表1 偽結核棒狀桿菌分離株藥敏試驗結果

注：R表示耐藥，S表示敏感，M表示中度敏感。

表2 不同稀釋度偽結核棒狀桿菌的致病性試驗

指壓有波動感，6 d接種部位相關淋巴結開始出現腫大，隨著病情發展，腫脹日益明顯，皮膚表面、皮下肌肉層和周邊淋巴結的腫塊切開后出現干酪樣膿汁，呈黃白色黏稠液體(圖5)，并從膿汁中分離到與攻毒菌相同的菌株。

2×106CFU/mL攻毒組山羊在感染3 d起接種部位出現腫脹，并出現持續2 d體溫升高，隨后腫脹逐漸變大，將腫塊切開后有干酪樣膿汁排出，但形成的腫塊小于2×108CFU/mL 攻毒組山羊。

2×104、2×103CFU/mL攻毒組山羊感染后接種部位觸摸無腫脹，無體溫升高。2×104CFU/mL攻毒組山羊剖檢觀察到淋巴結輕度腫大，切開后無膿汁排出。2×103CFU/mL 攻毒組山羊在整個試驗過程中接種部位皮膚表面、皮下肌肉層和周邊淋巴結均無膿腫形成。

2.7 組織病理學觀察

2.7.1 小鼠組織病理學觀察結果 發病小鼠皮膚表皮未見明顯病理變化，真皮及皮下組織可見壞死灶，并有大量炎性細胞浸潤(圖6-A)；皮下出現壞死，上皮樣細胞及成纖維細胞增生(圖6-B)；皮下組織部可見肉芽組織形成(圖6-C)；肌纖維斷裂、壞死，并有大量炎性細胞浸潤(圖6-D)。

2.7.2 山羊組織病理學觀察結果 發病山羊表皮觀察到出血和壞死(圖7-A)；表皮及真皮組織出現壞死，并有大量中性粒細胞浸潤(圖7-B)；壞死灶周圍可見肉芽組織形成(圖7-C)；皮膚化膿灶內大量膿細胞(圖7-D)。肌肉層可見大的壞死灶，肌纖維斷裂壞死，殘留肌纖維之間有大量淋巴細胞浸潤，成纖維細胞增生(圖7-E)；肌肉組織下化膿灶中心部分有大量崩解壞死的組織及中性粒細胞碎片(圖7-F)；肌肉肌纖維出現斷裂壞死，殘留肌纖維之間大量淋巴細胞浸潤，成纖維細胞增生(圖7-G)。淋巴結內有大小不等的化膿灶(圖7-H)；化膿灶周圍有大量上皮樣細胞增生(圖7-I)；化膿灶周圍成纖維細胞增生(圖7-J)。

3 討論

偽結核棒狀桿菌屬棒狀桿菌屬(Corynebacterium)，為兼性細胞內寄生菌，該細菌能夠產生壞死性、溶血性外毒素，其主要成分為磷脂酶[6]。病原菌侵入機體后，經過血液循環到達淋巴間隙或其他器官進行繁殖，形成特征性的局部化膿性壞死灶。該病主要通過消化道或創口感染， 肺臟亦可形成膿腫并經鼻腔排出病原菌，隨后經過皮膚傷口、口腔、呼吸道和生殖道侵入機體形成感染。澳大利亞、美國、日本和土耳其等國家均有偽結核感染的報道[7-10]；我國的內蒙古、陜西、甘肅、 新疆、云南、貴州、上海、浙江和廣東等地的羊群均有該病的發生[6，11-14]。本研究從安徽省馬鞍山市某養羊場發病羊的膿汁中分離到1株致病菌，經形態學特征觀察、生化分析和PCR檢測確定其為偽結核棒狀桿菌。

隨著我國養羊業迅速發展，羊群交易和調運頻繁，該病的發生呈上升趨勢，但是尚無特效疫苗可預防。目前，治療該病的方法主要有藥物治療和手術治療，臨床上常根據診斷結果，將發病羊的膿腫切開，排出膿汁，用H2O2清洗創口，撒上廣譜抗生素，同時進行肌肉注射用藥[15]。偽結核棒狀桿菌易產生耐藥性，治療前進行藥敏試驗，參考其結果用藥，可獲得良好的治療效果。同時，治療藥物交替使用，可降低耐藥性的產生。本試驗的藥敏結果顯示，分離細菌對青霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星和氟苯尼考最敏感，其次是新霉素、慶大霉素、氨芐西林、恩諾沙星、頭孢噻肟和紅霉素，對鏈霉素、丁胺卡那霉素、環丙沙星、林可霉素和大觀霉素產生了耐藥性。因此，臨床上應根據具體情況用藥，降低成本，提高治療效果。

本研究將偽結核棒狀桿菌進行人工感染試驗發現，腹腔注射的小鼠5 h出現不同程度發病癥狀，10 h開始死亡；皮下注射的小鼠接種部位出現大小不等的膿腫，感染小鼠的腎臟和肝臟均出現化膿灶。因此，分離菌株對小鼠的致病性較強。本研究還將不同劑量的病原菌皮下注射感染山羊，2×108CFU/mL 和2×106CFU/mL劑量組山羊攻毒后，觀察到體溫升高，注射部位出現腫大化膿，細菌通過淋巴管移行至相關淋巴結定殖，隨后肩前淋巴結開始腫大，切開腫脹的皮膚和淋巴結，均有干酪樣膿汁排出；2×104、2×103CFU/mL劑量組山羊攻毒后，無明顯的臨床癥狀，2×104CFU/mL劑量攻毒羊僅出現肩前淋巴結腫大，因此本研究攻毒用的偽結核棒狀桿菌感染山羊的最小發病劑量為2×106CFU/mL。潘淑惠等報道，細菌感染到達深部肌肉組織時，病原菌可通過淋巴管移行至淋巴結外，通過血管直至體內組織器官，在肺臟、肝臟和脾臟形成局灶性膿腫[16]，然而本試驗的攻毒羊各內臟均無膿腫形成。組織病理學檢查觀察到皮膚局部出現壞死灶，并有大量炎性細胞浸潤和肉芽組織形成；肌肉肌纖維斷裂壞死，大量炎性細胞浸潤和成纖維細胞增生；淋巴結內出現化膿灶，并在化膿灶周圍觀察到大量上皮樣細胞和成纖維細胞增生。該結果與潘淑惠等和蘭宇等研究得出的偽結核棒狀桿菌感染家兔和山羊的結論[16-17]一致，有助于正確理解該病原菌的發病機理和發病過程。

在養羊生產中，特別是放牧羊偽結核棒狀桿菌發病率較高，但由于其致死亡率較低，常被養殖戶忽視。然而，該病卻是世界公認的難以防治的傳染病之一，目前國內沒有疫苗進行防控，因此養羊場應采取綜合性的預防措施，隔離飼養發病羊，及時手術切除排出的膿汁并抗菌治療，同時搞好環境消毒，加強飼養管理，提高羊群的免疫力。由于該病原菌為人獸共患細菌，在處理病羊和清理污物時應加強個人防護[18]。

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