綿羊源地衣芽孢桿菌的分離和鑒定

祖麗胡瑪爾·艾尼

（塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300）

地衣芽孢桿菌是廣泛存在于自然環(huán)境中的需氧或兼性厭氧桿狀菌，大部分為非致病性菌，菌體桿狀兩端鈍圓或平截，產(chǎn)生芽孢，長(zhǎng)度可達(dá)10.0 μm。

地衣芽孢桿菌作為對(duì)宿主健康有益的天然治療劑，具有安全、無(wú)污染、不含殘留化合物等特點(diǎn)［1］，可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)，并產(chǎn)生短鏈脂肪酸提供能量，調(diào)節(jié)宿主腸道菌群平衡［2］。被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、制藥、農(nóng)業(yè)和工業(yè)及人類保健品等方面［3］。

地衣芽孢桿菌存在大量與碳水化合物代謝有關(guān)的基因，以及糖苷水解酶、多糖裂解酶和碳水化合物酯酶等［4］，這些代謝途徑中的酶可以幫助部分動(dòng)物消化。本研究經(jīng)過(guò)細(xì)菌分離純化及形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)、抑菌試驗(yàn)、16S rRNA 基因序列分析及小白鼠影響試驗(yàn)，為綿羊的生長(zhǎng)環(huán)境及天然放牧飼養(yǎng)方式研究、提高養(yǎng)殖收入提供理論依據(jù)，為綿羊飼料添加劑研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

阿克蘇某規(guī)模化羊場(chǎng)的一只綿羊胸腔滲出液。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

6 只健康昆明小鼠，體重16～22 g，購(gòu)自塔里木大學(xué)。

1.3 試劑與儀器

胰蛋白胨大豆肉湯，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；瓊脂粉，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂糖，購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司；藥敏片，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；T5 Zero Vector，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；搖床，購(gòu)自天津歐諾儀器股份有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）、DL-2000 Marker，購(gòu)自塔克藍(lán)生物科技有限公司；全能成像凝膠系統(tǒng)，購(gòu)自諾派森生物科技（上海）有限公司。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)菌分離純化及形態(tài)觀察 用接種環(huán)取胸腔滲出液劃線在胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)14～24 h。挑取單個(gè)菌落接種到胰蛋白胨液體培養(yǎng)基上，置于37 ℃、200 r/min 搖菌12～16 h，純化培養(yǎng)；采集綿羊血制備8%的鮮血培養(yǎng)基，將分離株接種到血平板上，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)22 h 后觀察溶血現(xiàn)象。

在無(wú)菌操作臺(tái)里，載玻片上滴1 滴蒸餾水，挑單個(gè)菌落涂布均勻，用酒精燈火焰固定后，結(jié)晶紫處理2 min、碘液處理3 min、酒精脫色30 s、復(fù)紅染色液復(fù)染30 s，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.4.2 生化試驗(yàn) 將菌液接種于生化管，37 ℃恒溫培養(yǎng)14～24 h 后觀察結(jié)果。

1.4.3 16S rRNA 鑒定 以提取的DNA 為模板，參照參考文獻(xiàn)［5］的細(xì)菌16S rRNA 基因擴(kuò)增引物，上游引物序列為27F 5＇ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇，下游引物序列為1 492R 3＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-5＇，目的條帶大小1 500 bp 左右，由上海桑尼公司合成，引物最終使用濃度為10 pmol/μL，稀釋后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR 擴(kuò)增體系25 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上下引物各0.5 μL，DNA 模板2 μL。PCR 擴(kuò)增程序，94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。取5 μL PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察結(jié)果。PCR 產(chǎn)物送上海賽恒生物科技有限公司測(cè)序。

1.4.4 檢測(cè)陽(yáng)性克隆 切膠后按照說(shuō)明書進(jìn)行膠回收，目的基因與T5 Zero Vector 連接轉(zhuǎn)化后，將產(chǎn)物在LB 液體培養(yǎng)基置200 r/min，37 ℃搖5 h 后，將菌液涂布到含Amp 的LB 瓊脂培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落加入5 μL 無(wú)菌水混合均勻作為模板DNA，上下引物用M13F、M13R 擴(kuò)增PCR。

PCR 擴(kuò)增體系25 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上下引物各0.5 μL，DNA 模板2 μL。PCR 擴(kuò)增程序，94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。取5 μL PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察結(jié)果。PCR 產(chǎn)物送上海賽恒生物科技有限公司測(cè)序。

1.4.5 抑菌試驗(yàn)

1）對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制。吸100 μL 新鮮的金黃色葡萄球菌菌液涂布至胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，用牛津杯打孔后將地衣芽孢桿菌接種至孔里，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)14～22 h 后觀察結(jié)果。

2）對(duì)大腸桿菌的抑制。吸100 μL 新鮮的大腸桿菌菌液涂布至胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，用牛津杯打孔后將地衣芽孢桿菌接種至孔里，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)14～22 h 后觀察結(jié)果。

3）對(duì)沙門氏菌的抑制。吸100 μL 新鮮的沙門氏菌菌液涂布至胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，用牛津杯打孔后將地衣芽孢桿菌接種至孔里，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)14～22 h 后觀察結(jié)果。

抑菌試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下，抑菌圈直徑均≥15 mm 為高度敏感，抑菌效果良好［6］。

1.4.6 藥敏試驗(yàn) 取100 μL 的菌液涂布到瓊脂培養(yǎng)基上，將藥敏片貼到菌液均勻的位置，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)14～22 h。測(cè)量藥敏圈直徑（Diameter of inhibition zone，DIZ）。

藥敏性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下，DIZ=0 mm 為不敏感；0 mm＜DIZ≤17 mm 為中敏感；DIZ＞17 mm 為敏感［7］。

1.4.7 對(duì)小白鼠的影響試驗(yàn) 小白鼠稱體重后，分別給試驗(yàn)組小白鼠注射菌液，對(duì)照組小白鼠注射等量的生理鹽水，其他管理措施不變，21 d 后觀察有無(wú)不良反應(yīng)、精神狀態(tài)、腹瀉、中毒等癥狀，結(jié)束后剖解觀察內(nèi)臟有無(wú)病理變化［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離純化及形態(tài)觀察

在胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)12～16 h結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1 可知，菌落為圓形白色，外觀扁平，不透明，邊緣不整齊，表面粗糙皺褶。在含8%綿羊鮮血培養(yǎng)基培養(yǎng)22 h 結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2 可知，將菌液接種到鮮血平板上培養(yǎng)后，能觀察到草綠色的α 溶血。革蘭氏染色鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3 可知，分離株為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌。

圖2 8%綿羊鮮血培養(yǎng)基的生長(zhǎng)結(jié)果

圖3 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果（10×100）

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

將分離株接種于生化管培養(yǎng)22 h，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 可知，分離株對(duì)淀粉水解、觸酶、VP、脲酶、甘露醇、硝酸鹽還原陽(yáng)性；對(duì)葡萄糖酸鹽、檸檬酸鹽、苯丙氨酸、木糖、棉子糖陰性。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 16S rRNA 基因鑒定結(jié)果

選擇16S rRNA 通用引物擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物1%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4 可知，PCR 擴(kuò)增成功，目的條帶大小1 500 bp 左右，符合預(yù)期大小。

圖4 16S rRNA 擴(kuò)增結(jié)果

2.4 檢測(cè)陽(yáng)性克隆結(jié)果

從含Amp 的瓊脂培養(yǎng)基挑單個(gè)菌落進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5 可知，目的片段大小為1 500 bp左右，與預(yù)期大小符合。

圖5 檢測(cè)陽(yáng)性克隆結(jié)果

2.5 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

取分離株100 μL 至對(duì)應(yīng)的孔里，抑菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2 可知，分離株對(duì)金黃色葡萄球菌高度敏感，對(duì)沙門氏菌中度敏感，對(duì)大腸桿菌低度敏感。

表2 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

將藥敏片貼到培養(yǎng)板上菌液均勻的位置，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)22 h，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，分離株對(duì)阿奇霉素、克林霉素耐藥，對(duì)四環(huán)素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、呋喃唑啉、慶大霉素、頭孢氨芐、萬(wàn)古霉素、頭孢呋辛、頭孢哌酮、頭孢拉定敏感。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.7 對(duì)小白鼠的影響

小白鼠沒(méi)出現(xiàn)不良反應(yīng)，精神狀態(tài)正常，無(wú)中毒癥狀和腹瀉，解剖后內(nèi)臟沒(méi)有病理變化，分析發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)小白鼠胸腺和脾臟的發(fā)育有促進(jìn)作用，對(duì)小白鼠的體質(zhì)有明顯的提高作用。

3 討論

本研究通過(guò)細(xì)菌分離純化及形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定試驗(yàn)、細(xì)菌16S rRNA 基因序列分析等方法，確認(rèn)從綿羊胸腔液分離到的菌株為地衣芽孢桿菌。

地衣芽孢桿菌是芽孢桿菌中應(yīng)用比較廣泛的菌株，國(guó)內(nèi)外對(duì)地衣芽孢桿菌應(yīng)用的報(bào)道較多［9-11］，地衣芽孢桿菌作為一種無(wú)毒、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性的益生菌在飼料生產(chǎn)中成為首選的飼料添加劑［12］，在醫(yī)學(xué)上成為增加空腸絨毛高度、改善腸道吸收功能的保護(hù)劑［13］，也可以抑制沙門氏菌［14］。在畜牧養(yǎng)殖方面，具有提高水產(chǎn)類的免疫力［15］、提高雞對(duì)沙門氏菌的抵抗力［16］等作用。進(jìn)一步挖掘新的芽孢桿菌資源，在世界范圍內(nèi)篩選自然環(huán)境中的芽孢桿菌，建立地方特色芽孢桿菌資源庫(kù)，利用地方特色菌服務(wù)當(dāng)?shù)兀?7］。地衣芽孢桿菌具有菌體繁殖速度快，易培養(yǎng)，抗逆性強(qiáng)，耐酸堿、耐高溫、耐膽堿，能分泌蛋白酶以及多種氨基酸等特點(diǎn)，在養(yǎng)殖業(yè)有較高的應(yīng)用價(jià)值。

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，藥物殘留和抗生素耐藥性呈上升趨勢(shì)，抑菌試驗(yàn)表明，如出現(xiàn)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌感染可以將地衣芽孢桿菌當(dāng)做抑制細(xì)菌的替代品。參考文獻(xiàn)［13］、［15］、［18］表明地衣芽孢桿菌對(duì)部分動(dòng)物具有促進(jìn)胃腸道功能、提高免疫力、提高肉雞的飼料利用率等作用。