OsCRY基因融合蛋白的表達(dá)純化及多克隆抗體制備

莊春紅　莊偉建

摘 要：藍(lán)光受體隱花色素是主要的光受體之一，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中一系列的生理生化及代謝反應(yīng)。本研究克隆了OsCRY1a、OsCRY1b、OsCRY2全基因的末端400bp到600bp，構(gòu)建了pET-29a（+）-OsCRY1a、pET-29a（+）-OsCRY1b、pET-29a（+）-OsCRY2基因高效表達(dá)載體，并在大腸桿菌中進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，分別獲得大約20-30kD的CRY融合蛋白，純化了CRY融合蛋白，并制備了多克隆抗體。

關(guān)鍵詞：隱花色素 融合蛋白 多克隆抗體

中圖分類(lèi)號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1003-9082（2018）01-0-02

光受體在植物的光形態(tài)建成中起重要作用，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中一系列的生理生化及代謝反應(yīng)[1]。隱花色素是在所有主要的演化譜系上基因表達(dá)光調(diào)節(jié)的藍(lán)光受體，但是其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制仍然還沒(méi)被完全揭示。光經(jīng)過(guò)這些受體進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起生理生化反應(yīng)，抑制下胚軸伸長(zhǎng)、調(diào)節(jié)開(kāi)花時(shí)間、氣孔開(kāi)放、刺激子葉擴(kuò)展、引導(dǎo)晝夜節(jié)律時(shí)鐘和調(diào)節(jié)基因表達(dá)等[2]，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，以更好適應(yīng)外界環(huán)境。本研究克隆了OsCRY1a、OsCRY1b、OsCRY2三個(gè)隱花色素基因末端400bp到600bp，構(gòu)建基因高效表達(dá)載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，純化出融合蛋白，制備多克隆抗體，為后續(xù)隱花色素基因的利用和改造奠定基礎(chǔ)。

一、材料與方法

1.材料

1.1菌種、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

大腸桿菌（ Escherichia coli）BL21和DH5α、質(zhì)粒pET29a（+） 均由本實(shí)驗(yàn)室保存。LB 培養(yǎng)基：10 g·L - 1蛋白胨， 5 g·L - 1 NaCl， 5 g·L - 1酵母粉，pH 7. 0； 120 ℃高壓滅菌20 min， 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2酶、生化試劑及試劑盒

Taq TM DNA聚合酶、膠回收試劑盒（ PCR Fragment Recovery Kit）及相關(guān)PCR引物購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，限制性?xún)?nèi)切酶和T4 連接酶購(gòu)自大連TaKaRa公司 ；Kan（卡那霉素） 、Amp （氨芐青霉素）、PMSF（苯甲基磺酰氟）來(lái)自美國(guó)AMERSCO公司；瓊脂糖（Biowest agarose） 、質(zhì)粒提取試劑盒（MediBEST Plasmid Purification Kit ）和Ni-NTA Superflow Cartridge購(gòu)自Qiagen公司（上海） ；ECL檢測(cè)試劑盒、 NC （硝酸纖維膜） 轉(zhuǎn)印膜為GE 公司產(chǎn)品； IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）購(gòu)自廈門(mén)星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司；弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑為北京鼎國(guó)公司產(chǎn)品；其余藥品為國(guó)產(chǎn)分析純生化試劑。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3只大耳成人家兔，體重約2 kg。

2.方法

2.1日本晴水稻基因組DNA的提取

用CTAB法[3]提取日本晴水稻基因組DNA。

2.2表達(dá)載體構(gòu)建

以含有CRY1a、CRY1b、CRY2粳稻日本晴基因組DNA模板，Oscry1acctpET-Nde1、Oscry1acctpET-Xho1、Oscry1bcctpET-Nde1、Oscry1bcctpET-Eag1、Oscry2cctpET-Nde1、Oscry2cctpET-Xho1為引物，PCR 擴(kuò)增獲得目的片段，回收產(chǎn)物經(jīng)Nde1和 Xho1、Nde1和Eag1、Nde1和Xho1雙酶切后連入pET29a（+）表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，重組質(zhì)粒鑒定后，送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。引物序列如下：

Oscry1acctpET-Nde1： 5acta-CATATG-gactcct ccgacgtgcc gccgat 3

Oscry1acctpET-Xho1： 5acta-CTCGAG-GCCTTCTCTCCCAGTCCAGTTGCT 3

Oscry1bcctpET-Nde1： 5 Caac-CATATG-tcctcggag gttccaccaattg 3

Oscry1bcctpET-Eag1： 5Atta-CGGCCGa-CCAAACTGGGACTACGCCTC 3

Oscry2cctpET-Nde1： 5cgac-CATATGa-cagaatggat tcatcatcca tg 3

Oscry2cctpET-Xho1： 5 ctta-CTCGAG-TGCGGCTTTTCGTTGTCTTGA 3

2.3 融合蛋白的表達(dá)

將表達(dá)載體pET29a（+）-cry1a、pET29a（+）-cry1b、pET29a（+）-cry2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21表達(dá)菌株[4]，在平板（50 μg/mL Kan+）上篩選，挑取單克隆菌落，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，測(cè)其OD值為0.5，加入IPTG誘導(dǎo)。4℃，5000rpm，離心10分鐘，收集菌體，棄上清。1 mL 菌液沉淀用100μL上樣緩沖液 （50mmol/Ltris-HCL（pH6.8）、 100mmol/L 二硫蘇糖醇、2%SDS （電泳級(jí)）0.1%溴酚藍(lán)、10%甘油） 重懸，煮沸4分鐘，離心后上清液，多克隆抗體在12%SDS-PAGE中分離檢測(cè)[5] 。

2.4融合蛋白的親和純化收集

100 mL 誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，離心收集沉淀。每克大腸桿菌中加3mlNPI-10（50mmol/L NaH2PO4、300mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑，pH8.0）或Buffer B（8mol/L尿素、100mmol/L NaH2PO4、100mmol/L Tris·Cl，pH8.0）重懸沉淀，低溫超聲破碎。每克菌加入8ul 50mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）和8ul溶菌酶（10mg/ml），在4℃下20min內(nèi)不時(shí)地進(jìn)行攪拌。一邊繼續(xù)攪拌一邊在每克大腸桿菌中加入4mg去氧膽酸[6]。放置懸浮液于37℃并用玻棒不時(shí)地?cái)嚢琛．?dāng)裂解物變粘稠時(shí)，在每克大腸桿菌中加入20ul 核酸酶（1mg/ml），室溫（25℃）貯藏直至裂解液不再粘稠。離心后，將上清載入Ni-NTA瓊脂糖親和層析柱，用5倍柱體積NPI-20（50mmol/L NaH2PO4、300mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑，pH8.0）或Buffer C（8mol/L尿素、100mmol/L NaH2PO4、100mmol/L Tris·Cl，pH6.3）沖洗3-5遍，再用NPI-250（50mmol/L NaH2PO4、300mmol/L NaCl、250 mmol/L咪唑，pH8.0）或Buffer E（8mol/L尿素、100mmol/L NaH2PO4、100mmol/L Tris·Cl，pH4.5）洗脫。最后收集洗脫組分，利用12%SDS-PAGE 進(jìn)行分離檢測(cè)。

2.5多克隆抗體的制備

將100?g抗原/兔溶入1ml磷酸緩沖溶液中待用并加入1ml弗氏不完全佐劑溶液，劇烈震蕩使之充分乳化，用5ml注射器抽取該乳化液，接上25G針頭，排除注射器中的氣泡。將兔子放在平坦處，在4個(gè)不同的部位進(jìn)行皮下注射，兩處在后背，兩處在大腿處[7]。在4個(gè)不同部位分別各注射約500?l抗原溶液。4-6周后再次注射抗原，并在注射后的7天-10天，每只兔子耳緣靜脈取血0.5～1 mL，分離抗血清。[8]

二、結(jié)果與分析

1.三個(gè)CRY基因PCR擴(kuò)增

以日本晴基因組DNA為模板， Oscry1acctpET-Nde1、Oscry1acctpET-Xho1、Oscry1bcctpET-Nde1、Oscry1bcctpET-Eag1、Oscry2cctpET-Nde1、Oscry2cctpET-Xho1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為單一條帶，且大小與預(yù)測(cè)基因一致，用膠回收試劑盒回收目標(biāo)條帶。

2.三個(gè)CRY基因表達(dá)載體的構(gòu)建

質(zhì)粒pET-29a（+）和目的片段酶切連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑選單克隆進(jìn)行振蕩培養(yǎng)后，分別以O(shè)scry1acctpET-Nde1、Oscry1acctpET-Xho1、Oscry1bcctpET-Nde1、Oscry1bcctpET-Eag1、Oscry2cctpET-Nde1、Oscry2cctpET-Xho1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選正確的克隆子。提取PCR檢測(cè)陽(yáng)性的克隆子重組質(zhì)粒，以Nde1和 Xho1、Nde1和Eag1、Nde1和Xho1進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證（圖1）。結(jié)果顯示，三個(gè)重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)均有雙條帶，且大小與預(yù)期結(jié)果一致。重組質(zhì)粒上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與已報(bào)道序列一致。

3.重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

三個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)至細(xì)胞密度（OD600）為0.5-0.6，加入終濃度為0.7 mmol·L - 1 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)3-4小時(shí)。誘導(dǎo)后的細(xì)菌細(xì)胞煮沸后12% SDS-PAGE電泳，顯示如圖2。誘導(dǎo)后融合蛋白大小均在20-30KD，連接6個(gè)His標(biāo)簽。

4.融合蛋白的分離純化

利用Qiagen公司的Ni-NTA Sp in Column進(jìn)行三個(gè)CRY融合蛋白的分離純化。用pH 7. 4的0. 05 mol·L - 1磷酸鹽緩沖液（含0 - 0. 5 mol·L - 1咪唑）的進(jìn)行梯度洗脫[9]，收集純化的重組CRY蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè) （圖3）。純化蛋白條帶單一，其純度高，可用于多克隆抗體的制備。

5.多克隆抗體特異性分析

將制備的多克隆抗體稀釋7500倍，以CRY1a、CRY1b、CRY2融合蛋白為抗原（100ng）進(jìn)行包被，三種多克隆抗體分別作為一抗，ELISA檢測(cè)顯示三種多克隆抗體分別有反應(yīng)，且有交叉反應(yīng)。以CRY1a、CRY1b、CRY2融合蛋白作為抗原（100ng），用三種多克隆抗體（1：500，1：2000，1：2000）進(jìn)行點(diǎn)雜交，發(fā)現(xiàn)融合蛋白只與對(duì)應(yīng)多克隆抗體有反應(yīng)，證明由此方法得出結(jié)果的多克隆抗體特異。

三、結(jié)論

本研究構(gòu)建了pET-29a（+）-OsCRY1a、pET-29a（+）-OsCRY1b、pET-29a（+）-OsCRY2三個(gè)高效表達(dá)載體，并在大腸桿菌中His誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，分別獲得大約20-30kD的CRY融合蛋白，并利用His標(biāo)簽純化出特異的融合蛋白，免疫家兔后可獲得較為特異的多克隆抗體。本研究為隱花色素轉(zhuǎn)基因水稻的功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)，以期進(jìn)一步深入了解水稻隱花色素基因各自的功能。

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作者簡(jiǎn)介：莊春紅，福建惠安，漢族，1988年2月出生，微生物學(xué)碩士研究生，主要研究方向微生物方向。