麒麟丸對糖尿病大鼠睪丸保護作用機制初步探究*

桂士良 崔大偉 王偉群 王茉琳 遲寶進魏 博 崔騰騰 羅振國 郭玉剛 曹會峰

1. 佳木斯大學附屬第一醫院泌尿科（佳木斯 154002）；2. 金華市中心醫院婦科；3. 佳木斯大學基礎醫學院

隨著經濟的發展，飲食結構的調整，糖尿病的發病率在逐年升高，有資料顯示2014年糖尿病在18歲以上人群的發病率為9%，近年來糖尿病出現年輕化趨勢，糖尿病引起的生殖功能損傷也逐漸引起重視。麒麟丸是我國眾多改善生殖功能中藥的一種，因其臨床顯著效果及能改善男女雙方生殖功能而被臨床廣泛應用，現初步探索麒麟丸在糖尿病大鼠中應用效果及可能機制。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

麒麟丸（國藥準字Z10930034，90g/瓶，廣東太安堂藥業股份有限公司）；鏈脲佐菌素（美國sigma）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物公司）；檸檬酸，檸檬酸鈉（天津市北辰方正試劑廠）；兔抗鼠AGEs抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)；兔抗鼠RAGEs抗體（英國abcam）；鼠抗兔二抗（北京中杉金橋生物公司）；血糖儀及血糖試紙（羅氏）；蛋白電泳及電轉膜系統（北京六一）。

二、實驗動物分組與糖尿病模型制備

6周齡清潔級雄性wistar大鼠，體質量180～220g，共60只（購于佳木斯大學實驗動物中心），飼養在佳木斯大學實驗動物中心獨立籠盒系統中，溫度18～24℃，濕度40%～80%，照明時間晝/夜12/12h。隨機分成A組（正常組）、B組（正常+麒麟丸）每組10只，模型組40只。A組、B組均自由飲水，自由飲食；模型組高脂高糖飲食（在標準飼料基礎上添加蔗糖、煉豬油、蛋黃，熱能21.6kJ/kg），自由飲水1個月。模型組大鼠禁食不禁水12h后按45mg/kg的STZ（STZ溶解于pH4.2～4.5檸檬酸緩沖溶液配制成1% STZ溶液）腹腔注射，注射結束后大鼠放回原籠盒系統正常進食，進水12h，再次禁食不禁水12h，同樣方法按30mg/kg腹腔注射STZ溶液，72h后測血糖一次，低于10mmol/L大鼠再次按30mg/kg腹腔注射STZ溶液，一周后禁食不禁水12h再次測血糖一次，血糖≥16.7mmol/L為造模成功，共25只，隨機分成C組（糖尿病組）12只和D組（糖尿病+麒麟丸）13只，均繼續高脂高糖飲食，B組和D組大鼠每天按0.36g/kg麒麟丸灌胃，動物中心飼養6周后測量大鼠體質量和血糖。

三、動物取材

10%水合氯醛腹腔注射（60～80mg/kg）麻醉大鼠，經腹腔切口取出雙側睪丸及附睪并稱量，左側睪丸生理鹽水清洗后立即凍存備用，右側睪丸生理鹽水沖洗后放入甲醛固定；取左側附睪按下述方法計數精子。

四、睪丸組織免疫組化和免疫印記

標本10%甲醛固定后常規脫水浸蠟后石蠟包埋，4μm切片，SP法制作免疫組化載玻片，蘇木素復染，鹽酸酒精脫色后返藍，再脫水后中性樹膠封片。

解凍標本，切成每塊0.1g，放入PV管中加入RIPA 500μL；冰上電動勻漿器研磨至混懸液；低溫離心機4℃，6000×g，離心60min，取部分上清液按BCA蛋白定量試劑盒操作說明行蛋白定量；同時分裝PV管中剩余上清蛋白樣本，分裝后按1:5加入loading buffer（5×），沸水煮蛋白15min，上樣電泳分離蛋白并電轉膜至PVDF膜上，依次脫脂奶粉封閉，孵育一抗，二抗，ECL化學發光，全自動化學發光成像系統曝光采象，結果按RAGEs /β-action表示。

五、附睪精子計數

取左側附睪置于6mL M-199精子孵育液中，眼科剪剪成微小碎塊，放置37℃水浴鍋孵育15min應用紅細胞計數板計數精子數量。

六、統計學分析

實驗結果計量數據采用均數±標準差表示，多樣本數據間比較采用方差分析，使用SPASS 19.0統計軟件對結果進行統計分析，設定P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、糖尿病大鼠體質量、血糖及睪丸質量

在糖尿病大鼠成模后出現多飲、多食、多尿、消瘦和毛發欠光澤，在飼養過程中C組大鼠死亡1只，6周后各組大鼠體質量和血糖值見表1，從表中看出糖尿病組大鼠較正常組大鼠體質量減輕，血糖升高；比較糖尿病大鼠和正常大鼠睪丸質量，差異具有統計學意義（P＜0.05），糖尿病組大鼠睪丸質量較正常大鼠睪丸質量減輕；比較正常組大鼠和正常組加麒麟丸干預的大鼠睪丸質量，差異無統計學意義（P＞0.05），比較麒麟丸干預的糖尿病大鼠和糖尿病組大鼠睪丸質量，差異具有統計學意義（P＜0.05），表明麒麟丸能改善糖尿病大鼠睪丸質量，對正常大鼠無影響。

表1 各組大鼠血糖、體質量及睪丸質量

二、附睪精子計數

附睪精子計數見表1，比較正常組大鼠與糖尿病組大鼠精子數，差異具有統計學意義（P＜0.05），說明糖尿病大鼠精子數量下降；比較糖尿病組大鼠和麒麟丸干預的糖尿病組大鼠精子數，差異具有統計學意義（P＜0.05），比較正常大鼠和麒麟丸干預的正常組大鼠精子數量，差異無統計學意義（P＞0.05），表明麒麟丸能改善糖尿病大鼠精子數量，對正常大鼠精子數量改善不明顯。

三、睪丸組織免疫組化和免疫印記

各組大鼠睪丸組織中終末糖基化產物（AGEs）結果如圖1所示，深色顆粒為陽性表達，通過計算吸光度值比較發現，正常組與糖尿病組大鼠睪丸組織陽性表達，差異具有統計學意義（P＜0.05），說明糖尿病組大鼠較正常大鼠睪丸組織中出現AGEs累積；糖尿病組和麒麟丸干預的糖尿病組大鼠睪丸組織陽性表達，差異具有統計學意義（P＜0.05）；正常組和麒麟丸干預的正常組大鼠睪丸組織中陽性表達，差異無統計學意義（P＞0.05），表明麒麟丸能改善糖尿病大鼠睪丸組織中AGEs的累積，對正常大鼠睪丸組織中AGEs累積影響不明顯。

圖1 各組大鼠睪丸組織AGEs免疫組化結果

各組大鼠睪丸組織中終末糖基化受體（RAGEs）表達情況（免疫組化見圖2，免疫印記見圖3），比較發現RAGs表達情況與AGEs累積成正相關，表明在糖尿病睪丸組織中AGEs累積能上調RAGEs表達，可能在糖尿病中AGEs通過其受體RAGEs作用影響糖尿病大鼠睪丸功能。

圖2 各組大鼠睪丸組織RAGEs免疫組化結果

圖3 各組大鼠免疫印記結果

討 論

糖尿病引起的男性生殖功能損傷作為糖尿病并發癥之一嚴重影響男性生殖功能[1]，近年來隨著飲食結構調整，糖尿病發病率不斷升高并出現年輕化趨勢，有資料顯示糖尿病人群發生生殖功能損傷是正常人群的5～10倍[2]，同時因為糖尿病引起的男性生殖功能損傷病因復雜治療困難，積極尋找致病機制成為研究熱點。

糖尿病是以血糖增高為主的一組代謝性疾病，包括糖脂代謝紊亂，內分泌失調，神經血管病變等[3]，因此糖尿病并發癥涉及多個系統，多種病因，研究發現高糖環境加快糖基化過程，引起多器官終末糖基化產物的累積，終末糖基化產物的累積被證實與糖尿病的多種并發癥相關[4-7]。在糖尿病大鼠睪丸組織中終末糖基化產物的累積同時上調終末糖基化產物受體表達對生殖功能損傷已經被證實[8,9]，因此，探索在糖尿病大鼠中降低終末糖基化產物對于其生殖功能的保護意義重大。

在大量臨床實踐和臨床研究中已經證實麒麟丸對男性少精和弱精療效顯著，并在臨床中廣泛應用[10,11]，作為我國傳統中藥之一為男性生殖作出極大貢獻。麒麟丸對糖尿病生殖損傷的研究罕見報道，本實驗即初步探索麒麟丸對糖尿病大鼠的生殖損傷保護作用及可能機制。實驗中發現糖尿病大鼠睪丸組織中終末糖基化產物累積明顯，終末糖基化產物受體表達明顯升高，與既往研究相符[8]，同時麒麟丸對糖尿病大鼠睪丸保護作用明顯，麒麟丸干預的糖尿病大鼠睪丸組織中終末糖基化產物的累積明顯減少，同時下調終末糖基化產物受體的表達，因此麒麟丸對糖尿病大鼠睪丸保護作用可能是通過干預糖尿病大鼠睪丸組織中終末糖基化產物的生成同時下調其受體的表達對其起保護作用。有研究發現終末糖基化產物通過受體介導引起睪丸組織氧化應激對睪丸生殖功能產生損傷[2]；既往許多研究均證實終末糖基化產物與睪丸生殖功能損傷存在相關性，本課題組前期研究亦發現終末糖基化產物能通過其受體降低硫化氫的產生，因此終末糖基化產物累積及受體表達上調是糖尿病生殖損傷的原因之一，麒麟丸能顯著改善糖尿病大鼠睪丸組織中終末糖基化產物的累積，下調其受體的表達，保護糖尿病大鼠睪丸的生殖功能，但對下游通路的干預尚不明確有待進一步探究。

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10 趙連明, 姜輝, 洪鍇, 等. 麒麟丸治療少弱精子癥患者的臨床研究. 中國男科學雜志 2016; 30(5): 40-42

11 孫捷, 應志偉, 吳麗萍, 等. 麒麟丸治療少弱精子癥的系統評價. 中國男科學雜志 2016; 30(4): 57-59,62