乳酸菌發酵大豆糖蜜生產乳酸及糖代謝變化

江楊娟，徐 麗，陳美思，周小敏，韓翠萍*，王 松*

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆是中國主要農作物之一，常被用來生產大豆蛋白，而大豆糖蜜是生產大豆濃縮蛋白過程中產生的副產物，據報道，每生產1 t醇法大豆濃縮蛋白將得到大約0.34 t大豆糖蜜[1]，因大豆糖蜜黏稠度高、色澤深，處理起來有很大的難度，故大部分大豆加工廠將其作為廢棄物或用作動物飼料低價出售，由于大豆糖蜜中大多數碳水化合物是結構多糖和含有半乳糖的低聚糖如水蘇糖和棉子糖，動物可能缺乏必要的內源酶來消化這些碳水化合物，因此又在一定程度上造成了資源浪費等問題[2]。同時，大豆糖蜜的組分豐富，含有高濃度的碳水化合物、蛋白質、脂肪、氨基酸和礦物質等[3-5]，所以大豆糖蜜是一種可以被再度利用的生物資源。近年來，關于大豆糖蜜中功能性成分的研究成果被大量報道，為大豆糖蜜資源的開發和利用提供了廣闊的前景。因大豆糖蜜中含有豐富的營養成分，常作為微生物的生長發酵劑。據Siqueira等[4]研究，大豆糖蜜的碳水化合物主要是由水蘇糖、棉子糖和蔗糖組成。目前，國內外大量學者研究以大豆糖蜜作為微生物的碳源來生產乳酸[6-7]、檸檬酸[8]、乙醇[9-10]等，且與常用的碳源葡萄糖相比，大豆糖蜜的價格僅為其20%，因此可以極大地節約成本并提高利潤[11]。

乳酸又可稱為α-羥基丙醇酸，廣泛存在于人類、動物和微生物的代謝機制中。乳酸作為21世紀最具應用潛力的有機酸之一[12]，既是重要的有機化工原料，又是重要的精細化學品，乳酸及其衍生物被廣泛應用于食品、飼料、日用品、化工等行業[13-16]。乳酸在全球的生產量已超越檸檬酸和乙酸，位居第一[17]，且為了大力開發環境友好型的生物可降解材料，乳酸將會逐漸替代石油基塑料產品。目前乳酸的生產方法主要有化學合成法、酶法及微生物發酵法[18]。國內外企業常用的生產乳酸方法是微生物發酵法，這主要是微生物發酵法可利用的原料來源廣泛，成本也較低，且生產的乳酸光學純度高，安全性好。

大豆糖蜜含有多種碳水化合物，主要含有的大量棉子糖和水蘇糖，大部分酵母菌均難以利用，而乳酸菌在代謝過程中能夠產生α-半乳糖苷酶水解水蘇糖和棉子糖生成乳酸和乙酸[19-20]。因此，本實驗選用6 株乳酸菌發酵大豆糖蜜生產乳酸，通過乳酸菌的生長特征、乳酸產量、大豆糖蜜的糖代謝來分析乳酸菌利用大豆糖蜜以及生產乳酸的能力，為大豆糖蜜的利用提供應用的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌植物亞種（Lactobacillus plantarum subsp.plantarum）CICC23168 中國工業微生物菌種保藏管理中心；德氏乳桿菌保加利亞亞種（L. delbrueckii ssp.bulgaricus）KLDS1.8501、嗜酸乳桿菌（L. acidophilus）KLDS1.0327來自于乳品科學教育部重點實驗室；嗜酸乳桿菌（L. acidophilus）ATCC11975、干酪乳桿菌（L. casei）ATCC393 美國典型培養物保藏中心；植物乳桿菌（L. plantarum）NAU322來自于實驗室篩選菌株。大豆糖蜜購自大慶日月星有限責任公司，大豆糖蜜的主要成分測定結果如表1所示。

表1 大豆糖蜜的化學成分Table 1 Chemical composition of soybean molasses

MRS肉湯活化培養基：酪蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，檸檬酸三銨2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。

大豆糖蜜培養基：酪蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，檸檬酸三銨2.0 g，吐溫80 1 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸錳0.05 g，15 °Brix大豆糖蜜1 000 mL、pH 6.0、121 ℃滅菌15 min。種子培養基同大豆糖蜜發酵培養基。

1.2 儀器與設備

Alliance 2695高效液相色譜儀、XBridge Amide色譜柱 美國Waters公司；Allegra X-30R多功能臺式離心機 美國貝克曼庫特公司；超凈工作臺 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；HPX-87H色譜柱 美國伯樂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的儲存和活化

將凍干的菌株在MRS肉湯培養基活化，再將活化后的菌液接種于種子培養基中，于37 ℃恒溫培養用于隨后的實驗。所有步驟都要求在無菌室操作進行。

1.3.2 乳酸菌發酵大豆糖蜜

分別將L. delbrueckii ssp. bulgaricus KLDS1.8501、L. acidophilus KLDS1.0327、L. acidophilus ATCC11975、L. plantarum subsp. plantarum CICC23168、L. casei ATCC393和L. plantarum NAU322接種于大豆糖蜜培養基。大豆糖蜜的可溶性固形物濃度通過加蒸餾水稀釋調節至15 °Brix。大豆糖蜜發酵培養基pH值用1 mol/L的NaOH溶液調至6.0。菌株在MRS肉湯培養基被活化，接種到種子培養基中，然后將種子培養液轉移到大豆糖蜜發酵培養基中，初始細胞濃度控制在1.05×107CFU/mL。在最佳溫度下，每隔8 h取樣，對發酵液中的乳酸菌活細胞數、碳水化合物含量及乳酸產量進行測定分析。

1.3.3 指標成分的測定

1.3.3.1 乳酸菌活細胞數的測定

按照1.3.2節操作，每隔8 h取樣大豆糖蜜發酵液，稀釋涂布平板測定活細胞數。

1.3.3.2 大豆糖蜜組成成分的測定

大豆糖蜜中的碳水化合物采用高效液相色譜法測定。蛋白質采用凱氏定氮法測定[21]。脂質經正己烷萃取后采用質量分析法測得[22]。大豆糖蜜樣品在550 ℃燃燒后用質量分析法測定灰分[23]。大豆糖蜜在105 ℃干燥后通過質量分析法測得水分含量[24]。

1.3.3.3 碳水化合物消耗量的測定

采用高效液相色譜測定發酵液中蔗糖、棉子糖、水蘇糖的含量。色譜條件為：Waters Alliance 2695色譜儀；色譜柱為Waters XBridge Amide（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；檢測器為Waters 2487示差檢測器；流動相為75%乙腈溶液；柱溫為55 ℃；流速為1 mL/min；進樣量為10 μL。

以峰面積為縱坐標，分別以蔗糖、棉子糖及水蘇糖含量為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程及相關系數：蔗糖：y=7 023.2x+1661.5，R2=0.995 6；棉子糖：y=6 014.7x-99.104，R2=0.999 8；水蘇糖：y=2 580.6x-6 298，R2=0.992 4。碳水化合物消耗量和利用率分別按公式（1）和（2）進行計算：

1.3.3.4 乳酸產生量的測定

采用液相色譜測定發酵液中乳酸的含量。色譜條件為：色譜儀為Waters Alliance 2695；色譜柱為Bio-Rad HPX-87H（300 mm×7.8 mm，9 μm）；檢測器為Waters 2487示差檢測器；流動相為5 mmol/L H2SO4溶液；柱溫為40 ℃；流速為0.5 mL/min；進樣量為20 μL。

以峰面積為縱坐標、乳酸產生量為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程及相關系數：y=9 034.9x+8 224.4，R2=0.999 8。乳酸產生量按公式（3）進行計算：

1.4 數據統計

每個實驗重復3 次，采用Microsoft Excel軟件計算平均值和標準差。方差分析采用SPSS軟件中的One-Way ANOVA進行分析；相關性分析采用SPSS軟件中的皮爾遜相關系數進行分析；采用Origin 9.0軟件進行繪圖；采用Microsoft Word進行表格制作。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌菌株的生長特征

圖1 6 種菌株在15 °Brix大豆糖蜜中的生長特征（37 ℃，pH 6.0）Fig. 1 Growth characteristics of six different strains in soybean molasses at 15 °Brix (37 ℃, pH 6.0)

如圖1所示，在15 °Brix的大豆糖蜜中，在37 ℃、pH 6.0條件下，L. plantarum subsp. plantarum CICC23168的遲滯期和對數期時間很短，8 h即進入到穩定期，其活細胞數達到最高值6.66×109CFU/mL，40 h以后進入衰亡期。L. acidophilus KLDS1.0327的最大活細胞數與L. plantarum subsp. plantarum CICC23168相似，其活細胞數也可達到3.98×109CFU/mL，但是需要48 h，且其遲滯期很長約24 h，因此其獲得最大細胞數需要時間過長。L. casei ATCC393和L. acidophilus ATCC11975的活細胞數與前2 株相比較低，都分別達到7.75×108CFU/mL和9.25×108CFU/mL，前者8 h活細胞數就可達到最大量，而后者需要32 h才能達到。L. delbrueckii ssp. bulgaricus KLDS1.8501和L. plantarum NAU322很快達到最大活細胞數，但與其他菌株相比活細胞數很低，僅為1.5×108CFU/mL和7.75×107CFU/mL，且兩株菌16 h后細胞開始衰亡，L. plantarum NAU322衰亡速率很快，8 h下降一個數量級，可能是因為耐酸能力較弱。

綜上所述，L. plantarum subsp. plantarum CICC23168是活細胞數最快能達到6.66×109CFU/mL的菌株，且穩定時間長，雖然L. acidophilus KLDS1.0327的活細胞數也能達到3.98×109CFU/mL，但是其遲滯期太長，而其他4 株乳酸菌的最高活細胞數遠遠低于L. plantarum subsp.plantarum CICC23168，說明L. plantarum subsp. plantarum CICC23168在大豆糖蜜中生長旺盛。

2.2 乳酸菌對大豆糖蜜碳水化合物的利用情況

圖2 6 株菌在48 h內對碳水化合物的利用Fig. 2 Carbohydrate utilization by six different strains in soybean molasses at 15 °Brix during 48 h

如圖2A所示，經過48 h發酵，L. acidophilus ATCC11975、L. acidophilus KLDS1.0327、L. plantarum subsp. plantarum CICC23168、L. delbrueckii ssp. bulgaricus KLDS1.8501和L. plantarum NAU322發酵底物中的蔗糖含量不斷下降，表明該5 株菌均有利用大豆糖蜜中的蔗糖的能力。其中L. plantarum subsp. plantarum CICC23168在發酵開始就水解蔗糖，16 h內發酵液中蔗糖含量快速下降，且蔗糖利用率很高，這可能是因為該菌的蔗糖酶是固有酶，可以很快適應蔗糖環境，而大豆糖蜜蔗糖含量很高，因此在大豆糖蜜中可以快速生長（圖1）[25-26]。L. acidophilus KLDS1.0327在發酵48 h內，發酵底物中的蔗糖含量先呈小幅度降低趨勢，24 h后突然大量代謝蔗糖，由圖2B和2C可知，在前8 h該菌對水蘇糖和棉籽糖的代謝量很小，而24 h后代謝量急劇增加，說明該菌對3 種糖的代謝啟動緩慢，可能是因為L. acidophilus KLDS1.0327中代謝這3 種糖所需要的酶是誘導酶，如蔗糖酶、α-半乳糖苷酶等。L. delbrueckii ssp. bulgaricus KLDS1.8501在發酵48 h內，大豆糖蜜中蔗糖含量呈降低趨勢，表明該菌具有水解蔗糖的能力，但是在32～40 h，蔗糖含量急速上升，可能是L. delbrueckii ssp. bulgaricus KLDS1.8501在此期間產生了蔗糖合成酶或是由于水蘇糖和棉子糖水解產生了部分蔗糖（圖2B和2C）。L. acidophilus ATCC11975和L. plantarum NAU322在發酵48 h內，大豆糖蜜中蔗糖含量小幅度降低，說明該2 株菌株利用蔗糖的能力并不強。L. casei ATCC393對蔗糖的利用情況與其他5 株菌有很明顯的差異，L. casei ATCC393在發酵48 h內，蔗糖含量呈現先上升后下降的趨勢，可能是由于L. casei ATCC393在發酵初始階段產生棉子糖系列寡糖水解酶活力大于蔗糖水解酶活力導致。

如圖2B所示，在發酵48 h內，6 株乳酸菌的發酵液中棉子糖含量均呈降低趨勢，說明6 株菌株均能利用大豆糖蜜中的棉子糖。其中L. delbrueckii ssp. bulgaricus KLDS1.8501、L. acidophilus ATCC11975、L. plantarum subsp. plantarum CICC23168和L. casei ATCC393在發酵48 h內，大豆糖蜜中的棉子糖含量呈小幅度降低趨勢，說明該4 株菌株水解棉子糖的能力并不強。而L. acidophilus KLDS1.0327在發酵24～32 h，棉子糖含量大幅降低，可能是因為L. acidophilus KLDS1.0327誘導產生了大量可水解棉子糖的胞外酶。L. plantarum NAU322在8～16 h棉子糖含量呈上升趨勢，可能是因為在此期間產生了棉子糖合成酶，因此棉子糖含量升高[27-28]。

如圖2C所示，在發酵48 h內，6 種菌株的發酵液中水蘇糖含量均呈降低趨勢，說明6 株菌株均有利用大豆糖蜜中的水蘇糖[29-30]的能力。其中，L. acidophilus KLDS1.0327對水蘇糖的利用最大，在24～48 h產生大量可水解水蘇糖的胞外酶，如α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶等[31]。

綜上所述，該6 株乳酸菌均能利用大豆糖蜜中的主要碳水化合物，其中L. acidophilus KLDS1.0327和L.plantarum subsp. plantarum CICC23168較其他菌株糖代謝能力強，發酵48 h后，碳水化合物的總消耗量分別為27.47 g/L和26.40 g/L，說明該2 株菌更具有以大豆糖蜜為底物發酵生產乳酸的潛力。

2.3 大豆糖蜜發酵生產乳酸

圖3 6 株菌種在大豆糖蜜中生產乳酸的情況Fig. 3 Lactic acid production of six different strains grown in soybean molasses at 15 °Brix during 48 h

由圖3可見，以15 °Brix大豆糖蜜作為發酵底物，在發酵48 h內，6 株菌的發酵液中乳酸產生量都有所增加，其中L. delbrueckii ssp. bulgaricus KLDS1.8501、L.acidophilus ATCC11975、L. casei ATCC393和L. plantarum NAU322這4 株菌的乳酸產生量較低，發酵48 h后乳酸產生量僅為2.95、2.50、4.18 g/L和5.86 g/L。而L. delbrueckii ssp. bulgaricus KLDS1.8501在發酵8 h內乳酸產生量快速增加，最大乳酸產生率為0.48 g/（L·h）。L. acidophilus KLDS1.0327在發酵24 h內，乳酸產生量很低，是因為L. acidophilus KLDS1.0327處于延滯期，活細胞數僅為2×107CFU/mL（圖1），幾乎未水解大豆糖蜜中的碳水化合物（圖2）。在發酵24 h后，乳酸產生量突然大幅度上升，因為該菌此時開始大量生長繁殖（圖3），加速利用大豆糖蜜中的碳水化合物，代謝生成終產物乳酸，發酵48 h后積累乳酸質量濃度為11.57 g/L。L. plantarum subsp. plantarum CICC23168在發酵48 h內，乳酸產生量隨著發酵的進行而逐漸升高，在發酵48 h時產生量為12.53 g/L，與其他5 株菌株相比較高；而在發酵24 h時，其乳酸產生量即可達12.18 g/L，相比48 h時雖差異顯著（P＜0.05 ），但24～48 h間僅合成乳酸0.35 g/L。

綜上所述，雖然L. acidophilus KLDS1.0327的乳酸產生量較高，糖代謝能力較強，但因其發酵時間過長，因此，判定其為利用大豆糖蜜生產乳酸的非優勢菌株。而L. plantarum subsp. plantarum CICC23168因其可以大量代謝大豆糖蜜中蔗糖，且在短時間內（8 h）生長量達到6.66×1010CFU/mL，且24 h內產生較高濃度乳酸，所以其具有作為利用大豆糖蜜生產乳酸的潛力。選擇24 h作為L. plantarum subsp. plantarum CICC23168的最佳發酵時間，從而節省生產成本。

3 結 論

在利用大豆糖蜜生產乳酸的研究中，發現L. delbrueckii ssp. bulgaricus KLDS1.8501、L. acidophilus KLDS1.0327、L. acidophilus ATCC11975、L. plantarum subsp. plantarum CICC23168、L. casei ATCC393和L. plantarum NAU322六株乳酸菌菌株均能利用大豆糖蜜產生乳酸。其中，在發酵24 h時，L. plantarum subsp.plantarum CICC23168的活細胞數達到6.66×109CFU/mL，乳酸產生量為12.18 g/L，總糖消耗量為22.48 g/L，與其他菌株相比有明顯優勢。L. plantarum subsp. plantarum CICC23168具有發酵時間短，活細胞數高，總糖消耗量大，乳酸產生量高的特點。說明L. plantarum subsp. plantarum CICC23168是能利用大豆糖蜜發酵產乳酸的潛力菌株。

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