天麻提取物及其3 種主要成分對灰樹花產胞外漆酶和菌絲體的影響

蘆紅云，吳天祥,2,*，鐘 敏，聶文強

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學明德學院，貴州 貴陽 550025）

漆酶是微生物中廣泛存在的一種含銅多酚氧化酶，在食品[1-2]、環境[3]、生物漂白[4-5]等領域具廣闊的應用前景，是近年來的研究熱點。擔子菌中的白腐菌是漆酶重要的生產者。灰樹花（Grifola frondosa）屬于白腐菌，在生產栽培時，分泌漆酶來降解底物秸稈皮殼中的木質素供自身生長。Nitheranont等[6]研究指出灰樹花漆酶能有效應用于合成染料的脫色以及雙酚A的降解。目前，外源添加物對真菌漆酶影響的研究主要集中在添加金屬離子、芳香族化合物、有機酸等[7-10]，對于添加中藥成分的研究鮮有報道。齊艷兵等[11]研究表明酚類底物中的基團如—NH2、—OH、—OCH3及—CHCHCH3等，能夠明顯增強漆酶反應活性。同時，文獻[12-14]指出一些中藥藥渣和中藥提取物可顯著促進真菌生長及漆酶的產生。

天麻作為貴州三寶之一，是一種名貴的中藥材，其活性成分主要是以天麻素（gastrodin，GA）、對羥基苯甲醇（p-hydroxybenzyl alcohol，HA）、對羥基苯甲醛（p-hydroxylbenzaldehyde，HBA）為主的酚類、有機酸、甾醇、苷類等[15-17]，這些物質的存在是研究天麻對漆酶活力影響的基礎。Xing等[9]研究指出HBA能促進灰樹花產漆酶，同時，課題組[16-21]前期研究也表明，天麻提取物及其主要成分能促進灰樹花生長。

實驗以灰樹花菌株為研究對象，研究天麻提取物對灰樹花產胞外漆酶和菌絲體生長的影響，并在此基礎上分析天麻主要成分GA、HA、HBA[22]對灰樹花生長和產漆酶的影響，來探明對其增效貢獻最大的成分，并闡明作用機理，旨在為天麻提取物及主要成分誘導產漆酶提供理論依據。GA、HA、HBA的結構式如圖1所示。

圖1 GA、HA、HBA的結構式Fig. 1 Structures of GA, HA and HBA

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及培養基

灰樹花菌株（菌種編號：5.404） 中國普通微生物菌種保藏管理中心；天麻（Rhizoma gastrodiae）貴州省德江縣天麻種植基地。

GA、HA、HBA 美國Sigma公司；2,2’-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）、L-天冬酰胺美國Amrescoa公司；其余試劑均為市售分析純。

斜面培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基；液體種子培養基：葡萄糖30 g/L，蛋白胨2 g/L，酵母膏6 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L；pH值自然；發酵培養基（每1 L含有如下物質）[9]：葡萄糖10 g，L-天冬酰胺5 g，Na2HPO40.475 g，KH2PO40.453 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.013 g，酵母膏提取物1 g，VB125 mg，痕量溶液1 mL（痕量溶液組成：檸檬酸鐵4.8 g/L，ZnSO4·7H2O 2.64 g/L，MnCl2·4H2O 2.0 g/L，COCl2·6H2O 0.4 g/L，CuSO4·5H2O 0.4 g/L）。

1.2 儀器與設備

BXM-30R立式滅菌鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-1D凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；TGL-20M臺式高速冷凍離心機 長沙邁佳森儀器設備有限公司；TS-2102C恒溫振蕩器 上海天呈儀器有限公司；UV-1800雙光速紫外-可見光光度計 上海欣茂儀器有限公司；1100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀及檢測器、5TC-C18色譜柱 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 斜面種子培養

從母種試管中挑取黃豆粒大小菌絲塊接種于PDA斜面中部，25 ℃恒溫培養，至菌絲長滿整個斜面，轉置4 ℃保存。

1.3.2 液體種子培養

用接種勺在斜面菌種管中取1 勺細小菌絲體，接種于液體種子培養基中，三角瓶裝液量為200 mL/500 mL，加入少許細小玻璃珠，于25 ℃、150 r/min搖床中培養6 d。

1.3.3 發酵培養

無菌條件下，按10%的接種量，用移液槍取5 mL種子液接于發酵培養基中，250 mL三角錐形瓶裝液量為50 mL，于150 r/min的搖床中25 ℃條件下培養。

1.3.4 天麻提取物和粗酶液的制備

天麻粉制備：天麻洗凈，55 ℃烘干，粉碎后過80目備用。

天麻醇提物制備：準確稱取上述10 g的天麻粉末，加入100 mL 75%乙醇溶液。25 ℃浸提48 h后過濾，60 ℃減壓除去乙醇。加25 mL蒸餾水重溶后過濾，即得到2.5 mL/g的天麻醇提物。

天麻水提物制備：將上述10 g的天麻粉末加入到100 mL的蒸餾水中。25 ℃浸提48 h后過濾得到濾液，60 ℃減壓濃縮，定容至25 mL，即得到2.5 mL/g的天麻水提物。

粗酶液制備：將發酵液經8 層紗布過濾，濾液在轉速為6 000 r/min條件下4 ℃低溫離心10 min。

1.3.5 外源誘導實驗

分別向液體培養基中加入不同體積分數的天麻提取物、GA、HBA、HA及不同質量的天麻粉末，使其達到設定的最終質量濃度，并以此為實驗組，以未額外加入任何外源物的液體培養基為對照組。兩者均經過高壓滅菌，再接入種子液。發酵一定時間后，進行指標測定，以考察所添加的外源誘導物對灰樹花菌絲體生長和誘導產胞外漆酶的影響。

1.3.6 指標測定

1.3.6.1 菌絲體生物量的測定

菌絲體生物量用來評價灰樹花的生長情況。液體培養過濾后得到菌絲體，將其用蒸餾水沖洗3 次，于數顯鼓風干燥箱中60 ℃烘干至恒量，其質量即為菌絲體生物量。

1.3.6.2 漆酶活力測定[23]

以ABTS為底物，2.5 mL反應體系中含有1 mL 0.03 g/100 mL ABTS、1 mL pH 2.2磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液和0.5 mL粗酶液。在1 cm的比色皿中，將緩沖液和底物混勻后再加入酶液，在25 ℃反應3 min后，在420 nm波長處測吸光度的增加值。煮沸15 min滅活的粗酶液經相同處理后為對照組。酶活力定義：每分鐘使1 μmol ABTS轉化所需的酶量為1 個活力單位（U）。計算公式如下：

式中：ΔA為吸光度的差值；V總為反應體系總體積/mL；V酶為酶液體積/mL；ε=3.6×104L/（mol·cm）；L為比色皿直徑/mm；Δt為反應時間差/s。

1.3.7 HPLC分析[22]

1 mL發酵液經膜過濾（0.22 μm）后，用HPLC檢測。條件如下：色譜柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸溶液（流動相A）和乙腈（流動相C）。洗脫梯度：0～35 min，3%～30% C；35～45 min，30%～70% C。流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，檢測波長221 nm。

1.4 統計方法

采用SPSS 17.0軟件分析實驗數據顯著性；Origin 7.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 灰樹花菌絲體生長曲線及產漆酶情況

圖2 培養時間對灰樹花菌絲體生長及漆酶活力的影響Fig. 2 Effect of culture period on mycelial growth and laccase activity of G. frondosa

在無外源添加物的灰樹花液體發酵培養基中，每隔1 d隨機取3 瓶發酵液，測定其胞外漆酶活力和菌絲體生物量。由圖2可知，搖床培養至12 d時灰樹花漆酶活力和菌絲體生物量達到峰值，分別為19.63 U/L、3.06 g/L。1～4 d，灰樹花處于調整期，產漆酶活力較低，發酵液中菌絲球極少；4～10 d，灰樹花進入指數生長期，漆酶的活力迅速升高，發酵液呈微黃透明，菌絲球體積逐步變大，新長出來的細小菌絲球較多；10～12 d，灰樹花菌體生長進入穩定期，其所產漆酶活力達到峰值，發酵液顏色逐步加深，菌絲球邊緣齊整；12 d以后，隨著菌絲體進入衰亡期，漆酶活力逐漸降低，發酵液顏色漸深而且黏度增加，菌體出現自溶現象。因此，培養最佳周期為12 d?？v觀整個培養階段可知，灰樹花所產漆酶活力較低，與尹立偉[24]、Sun Shujing[25]等研究結果一致。王宜磊等[12]研究出枸杞子水提物能提高真菌胞外漆酶活力。后期實驗將以天麻提取物為誘導物來研究其對漆酶活力的影響，以期提高漆酶活力。

2.2 不同質量濃度的天麻粉末及提取物對灰樹花漆酶和菌絲體的影響

在裝有灰樹花液體培養基的三角瓶中，分別添加質量濃度為1～7 g/L的天麻粉末和天麻提取物（天麻粉末經過水提或乙醇提取后的到的物質）。發酵培養12 d后，研究外源誘導物對灰樹花菌體生長和產胞外漆酶活力的影響。由圖3、4可知，外源物對灰樹花菌絲體和胞外漆酶活力均有顯著的促進作用。從整體看，隨著外源物質量濃度提高，灰樹花生物量和漆酶活力均呈現先增加至峰值后再降低的趨勢，出現這種趨勢的原因可能是天麻中除了含有誘導漆酶分泌芳香族化合物和糖苷類物質外[26]，還含有一定量抑制真菌活性的有機酸（酯）類揮發油性成分和生物堿[27]，當質量濃度不斷增大時，糖苷類物質和芳香族化合物的誘導作用逐步達到最大值，繼續增加藥渣質量濃度，其中揮發油性成分和生物堿抑菌活性的作用逐漸顯現，漆酶活力和菌絲體生物量又逐漸下降。

圖3 添加物質量濃度對灰樹花漆酶活力的影響Fig. 3 Effect of R. gastrodiae extract concentration on laccase activity of G. frondosa

圖4 添加物質量濃度對灰樹花菌絲體生長的影響Fig. 4 Effect of R. gastrodiae extract concentration on biomass production by G. frondosa

由圖3可得出，天麻提取物的提取方式不同對誘導漆酶活力的影響不明顯。在3 g/L天麻醇提物、4 g/L天麻水提物、5 g/L天麻粉末的誘導下，漆酶活力均達到峰值，分別為（106.46±1.25）、（105.25±1.24）U/L和（107.07±1.4）U/L。圖4中，在3 g/L天麻醇提物、2 g/L天麻水提物、4 g/L天麻粉末誘導下，菌絲體生物量達到各自的峰值，分別為（10.03±0.06）、（5.88±0.14）、（9.03±0.07）g/L，且差距顯著。

因此，選擇3 g/L的天麻醇提物作為誘導物添加到灰樹花深層發酵中，此時對菌絲體生長和漆酶的促進作用最大，分別為（10.03±0.06）g/L、（106.46±1.25）U/L，相較于空白組，分別提高了1.62 倍和7.41 倍（P＜0.05）。有理由推測天麻醇提物中存在某些對灰樹花菌絲體生長和產漆酶增效的成分。

2.3 天麻醇提物中3種主要成分的HPLC分析

圖5 天麻醇提物（a）和GA（b）、HA（c）、HBA（d）標準品的HPLC圖Fig. 5 HPLC chromatograms of R. gastrodiae extract and GA, HA and HBA standards

因含外源添加物的灰樹花液體培養基需經高壓滅菌，且基于課題組前期研究表明，天麻提取物滅菌操作后組分含量發生變化，活性成分GA、HBA、HA的含量會上升[28]。故利用滅菌后的天麻提取物進行HPLC分析，來探明天麻醇提物中對灰樹花漆酶活力具有最顯著促進作用的主要成分。由圖5a可知，滅菌后的3 g/L的天麻醇提物主要成分有GA、HA、HBA等，計算出各成分的含量分別為5.556、1.265、1.417 mg/g。

2.4 天麻主要成分對灰樹花漆酶活力和菌絲體生長的影響

圖6 天麻醇提物和3 種天麻成分對灰樹花漆酶活力影響的比較Fig. 6 Comparative effects of 3 g/L R. gastrodiae extract, GA, HA and HBA on laccase activity of G. frondosa

圖7 天麻醇提物和3 種天麻成分對灰樹花菌絲體生長影響的比較Fig. 7 Comparative effects of 3 g/L R. gastrodiae extract, GA, HA and HBA on mycelial biomass production by G. frondosa

將3 g/L的天麻醇提物和相應含量的3 種主要成分添加到灰樹花液體培養中作為實驗組，對照組中不含任何外源添加物，考察對灰樹花生長和產漆酶起關鍵作用的主要成分。由圖6、7可以看出，相較于對照組，實驗組中添加的外源物均能有效促進灰樹花菌絲體生長和其分泌的胞外漆酶活性。

由圖6可知，HA、HBA和天麻醇提物對漆酶活力有明顯促進作用。HA、HBA促進漆酶活力可能與苯環中含有羥基有關[11]。添加HA時酶活力最大為（104.14±1.28）U/L，相比添加3 g/L天麻醇提物的實驗組，其酶活力提高10.25%，說明相較于添加天麻醇提物，HA對漆酶活力的促進作用更強。由圖7可知，灰樹花液體培養添加HBA時菌絲體的生物量為（8.92±0.12）g/L，與添加天麻醇提物的實驗組菌絲體生物量（8.07±0.19）g/L相比，菌絲體生物量提高9.17%。說明前者更能促進菌絲體的生長，其原因可能是天麻醇提物存在某些抑制真菌生長的物質，與2.2節的分析一致。

2.5 不同濃度的HA、HBA、GA對漆酶活力的影響

圖8 不同濃度HA、HBA、GA對灰樹花漆酶活力影響的比較Fig. 8 Effect of different concentrations of HA, HBA and GA on laccase activity of G. frondosa

為確定天麻3種主要成分對漆酶影響最佳添加量，分別稱取7.4、7.3、17.2 mg的HA、HBA和GA溶于10 mL蒸餾水中配成溶液。按一定的體積梯度添加到每瓶液體培養基中，使灰樹花液體培養基中HA、HBA和GA最終濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L。發酵12 d后，根據每瓶中測得的漆酶活力考察3種成分對漆酶的影響。如圖8所示，漆酶活力隨著HA、HBA濃度的增加呈現先上升后下降的趨勢，然而漆酶活力并沒有隨GA濃度增加而明顯上升，甚至較早出現穩步下降的趨勢。與對照組相比，HA濃度在0.05～0.3 mmol/L、HBA濃度在0.05～0.2 mmol/L均能顯著促進漆酶活力（P＜0.05），其中，HA濃度在0.2 mmol/L時，灰樹花胞外漆酶活力促進作用最佳，此時漆酶活力值為（97.53±1.96）U/L，相較于對照組提高了3.65 倍。因此，在所添加的3 種天麻主要成分中，0.2 mmol/L HA對促進漆酶活力的貢獻最大。

2.6 不同濃度的HA、HBA、GA對菌絲體生物量的影響

圖9 不同濃度HA、HBA、GA對灰樹花菌絲體生物量影響的比較Fig. 9 Effects of different concentrations of HA, HBA and GA on mycelial biomass production by G. frondosa

按照一定的體積梯度向裝有50 mL灰樹花液體培養基中添加少量HBA、HA及GA，使得這些成分最終濃度分別為0.2～1.4 mmol/L，發酵12 d后測菌絲體生物量。由圖9可知，菌絲體生物量均隨著添加物濃度的升高先上升后下降；其中HBA濃度在1 mmol/L時對菌絲體生物量的促進作用達到最大值，為（6.17±0.16）g/L，相較于對照組提高了2.13 倍。因此，3 種添加物中，HBA對菌絲體生物量促進作用最大。

3 結 論

實驗開展了關于天麻提取物對灰樹花深層培養中的產胞外漆酶和菌絲體生長影響的研究。通過比較培養時間對漆酶和菌絲體干質量的影響，得出了灰樹花液體培養的最佳培養周期是12 d；添加不同質量濃度的天麻提取物于灰樹花液體培養基，測定出當加入3 g/L的天麻醇提物時，此時菌絲體生物量和漆酶活力均達峰值，分別為（10.03±0.06）g/L、（106.46±1.25）U/L，相較于對照組，分別提高了1.62 倍和7.41 倍。其誘導漆酶機理可能是這些外源添加物中存在某些結構中含有芳基和羥基化合物，而芳基和羥基是漆酶作用底物的特征官能團，所以它們能夠誘導菌體分泌更多的漆酶[29-30]。

利用HPLC對3 g/L的天麻醇提物的成分進行分析，得到GA、HA、HBA的含量分別為5.556、1.265、1.417 mg/g，將其與3 g/L的天麻醇提物分別添加到培養基中作為實驗組，相較于空白組，這些外源添加物均能有效促進灰樹花菌體生長和漆酶活力。其中，HA能顯著促進灰樹花分泌的漆酶活力；HBA能顯著增大灰樹花的生物量，與吳彩云等[21]研究結果一致。天麻醇提物成分復雜，影響漆酶活力的物質也較多。天麻醇提物中是否存在某些物質較對羥基苯甲醇對漆酶活力具有更強的促進作用，需要進一步研究。

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