鉤藤活性成分研究進展

劉碧崇， 王 強

(1.成都大學 藥學與生物工程學院； 四川 成都 610106； 2.眉山碧叢生物技術有限公司， 四川 成都 620020)

0 引 言

鉤藤，茜草科鉤藤屬藤本植物，是常用的一種中藥，主要分布于云南、貴州及廣西等地，四川亦有極少量的分布.目前，科研人員對鉤藤的研究主要集中于對其藥用活性成分提取、分離與鑒定等方面.研究發現，鉤藤堿是鉤藤最主要的活性成分，具有廣泛的藥理活性[1-2]，其可通過阻滯交感神經及神經節的過度興奮，促使外周血管擴張、抑制胞內CA+釋放等[3-7]途徑對原發性高血壓、心血管擴張、動脈粥樣硬化以及心律失常常見心血管疾病產生一定的療效[8-11].雖然鉤藤堿的藥理活性較為廣泛，但因作用較弱的致命缺點，無法以單體化合物成藥.

絨毛鉤藤，茜草科鉤藤屬滕蔓生木本植物，為美國中部及南美亞馬遜雨林特有的一種熱帶植物.絨毛鉤藤的水溶性提取物(多組分)，是從絨毛鉤藤樹皮或其他部分提取的水溶性成分.研究顯示，絨毛鉤藤的水溶性提取物具有抗炎、抗氧化等藥理作用，可通過抗炎、抗氧化等機制，增強免疫、增強細胞修復和調節等途徑產生抗腫瘤、神經保護、細胞生長調節等功效，進而對多種疾病具有一定的療效[12-15].

1 神經保護作用

近年來，關于鉤藤提取物的神經保護作用的報道較多，研究結果證實，鉤藤中具有神經保護作用的物質基礎包括鉤藤總堿、異鉤藤堿等化合物，均具有顯著的神經保護作用[16-20]，它們可以通過清除過氧化脂質體及代謝產物、抗氧化、抑制谷氨酸損傷等機制保護細胞、抵抗癡呆[21-23].此外,鉤藤水提物、異鉤藤堿等成分可以改善Aβ蛋白變性導致的神經細胞損傷[24-25]，可以改善由東莨菪堿激發的記憶障礙模型小鼠的記憶功能;采用70%乙醇進行萃取鉤藤得到的復合物，以及單組分異鉤藤堿，可以改善D-半乳糖導致的記憶損傷[26-27].例如，黃厚才等[28]的研究結果顯示，中藥鉤藤散制劑具有神經保護作用，保護腦內神經細胞，對老年癡呆模型小鼠產生一定的治療作用，能提高模型小鼠的腦指數.李超等[29]將鉤藤總生物堿與雷帕霉素進行對比研究，結果顯示，鉤藤總生物堿可以通過多種途徑促進自噬小體產生，從而降低細胞因為氧化應激而導致的炎性反應，降低細胞凋亡的比例.

Sandoval等[30]對比了Uncaria tomentosa和Uncaria guianensis的藥效差異，在該研究中結合了反向高效液相色譜法、分光光度法測定二者的生物堿、黃酮醇、羥基自由基、脂質過氧化物含量，并采用ELISA法檢測TNFα的釋放情況，評估了絨毛鉤藤和圭亞那鉤藤的抗炎活性.在其機理研究中，用TUNEL法和原位RT-PCR技術檢測了TNFαmRNA的表達情況，研究結果顯示，在抗氧化試驗中，絨毛鉤藤比圭亞那鉤藤更有效.絨毛鉤藤具有顯著的抗氧化和抗炎活性，并且不受氧化吲哚或五環生物堿的存在的影響.

由于絨毛鉤藤提取物具有較強的抗氧化活性，能修復DNA損傷、刺激髓系祖細胞的增殖并引起腫瘤細胞的凋亡.對于正在接受癌癥治療的病人來說中性粒細胞減少是化療最常見的副作用，絨毛鉤藤提取物能刺激健康造血組織細胞增殖，對患者來說具有重要的意義.Farias等[31]研究了絨毛鉤藤對不規則細胞生長調節作用發現，絨毛鉤藤對粒細胞—巨噬細胞集落形成細胞(CFU-GM)以及化療引起的白細胞減少后中性粒細胞恢復有重要影響，經絨毛鉤藤治療后，患者中性粒細胞計數和效力顯著增加，體外試驗顯示，絨毛鉤藤能刺激髓系祖細胞數量顯著增加，故將絨毛鉤藤用于減少化療導致的副作用方面具有極大的潛力.Domingues等[32]研究了絨毛鉤藤的水—乙醇提取物的免疫調節作用對免疫介導糖尿病的治療作用.在該研究中，采用HE染色法和免疫組化染色分析胰腺單核細胞浸潤情況，并用數字形態測量法測定β細胞胰島素含量，通過流式細胞儀分析了淋巴細胞免疫表型.研究結果顯示，50～400 mg/kg的絨毛鉤藤水—乙醇提取物對糖尿病模型小鼠具有顯著的治療作用，模型小鼠的血糖水平顯著下降，糖尿病發病率顯著降低.胰島細胞的形態分析顯示絨毛鉤藤的水—乙醇提取物對胰島細胞具有明顯的保護作用.動物治療的UT在400 mg/kg提出了更高更完整的胰島并且對胰島的破壞有明顯的抑制作用.此外，通過免疫組織化學評估，觀察到了對β細胞分泌胰島素的保護作用.表型分析顯示，高劑量組(100～400 mg/kg)處理的CD4和CD8+T細胞值與健康動物相似并增加了CD4+CD25+調節性T細胞的數量.絨毛鉤藤水溶性提取物可通過不同途徑控制免疫介導糖尿病的進展.Maria等[33]評估了絨毛鉤藤對缺血性急性腎損傷的腎臟保護作用.結果表明，絨毛鉤藤具有顯著的腎臟保護作用，具體機制可能與其抗氧化作用有關.

2 鎮痛活性研究

結合目前國內外對鉤藤等茜草科類植物藥用成分的研究結果來看，鉤藤提取物中的少量帽柱木堿可直接激活μ-阿片受體(μ-opioid receptors,MORs)發揮鎮痛活性[34-35].在上個世紀90年代，科研人員就從鉤藤中分離出了帽柱木堿[36-37].帽柱木堿(mitragynine)，最初是從茜草科屬植物美麗帽柱木(又名卡痛)葉片中分離得到的生物堿.由于帽柱木堿在鉤藤中的含量較低，并未獲得足夠的重視，導致目前國內少有關于帽柱木堿藥理作用的研究報道.而從國外的文獻來看，絨毛鉤藤中也分離出了帽柱木堿.科研人員對帽柱木堿進行了較為深入的研究，現已明確其作用機理.例如，Kruegel等[34]的研究成果證實，帽柱木堿及部分結構相似的衍生物，能夠結合并激活μ阿片受體(μ-opioid receptors,MORs).其中，7-羥基帽柱木堿(7-hydroxymitragynine)的藥理活性最強，MOR效力是嗎啡的十分之一；帽柱木堿的藥理活性比7-羥基帽柱木堿弱，僅為其十分之一.進一步的機理實驗表明，帽柱木堿與μ阿片受體(MORs)結合并活化MORs后，激活的信號通路與β-arrestin通路無關.而關于β-arrestin通路的大量研究結果已經證實，β-arrestin通路介導了很多傳統阿片受體激動劑的不良反應，例如便秘、呼吸抑制和耐藥性.這些研究結果提示我們，帽柱木堿及其衍生物雖然是通過激活μ阿片受體而產生鎮痛作用，但其可能不會導致傳統的阿片受體激動劑所造成的便秘、呼吸抑制和耐藥性.7-羥基帽柱木堿似乎可以代替嗎啡用于某些較為輕微的疼痛.此外，在光照和氧化條件下，溶液中的帽柱木堿有幾乎一半通過氧化反應，轉化為7-hydroxymitragynine.由于帽柱木堿的穩定性極差，即便在光照條件下，大約8%的帽柱木堿會轉化為7-羥基帽柱木堿.Takayama等[35]利用豚鼠離體回腸試驗對帽柱木堿及其衍生物的藥理學活性實驗結果顯示，帽柱木堿的鎮痛活性具有顯著的濃度依耐性.小鼠腦側室注射給藥甩尾實驗結果顯示，帽柱木堿具有顯著的鎮痛活性，但活性明顯弱于嗎啡.

此外，劉碧崇等[38-39]研究表明，鉤藤提取物具有一定的鎮痛作用，但尚不清楚具體成分.但鉤藤水提物可通過抑制中性內肽酶降解內啡肽，產生一定的鎮痛作用.

雖然帽柱木堿的鎮痛活性已經明確，但其機制與抑制腦啡肽酶水解內啡肽的機制不一致，存在多種可能性.鉤藤水溶性提取物中的鎮痛活性成分的分離、鑒定等后續研究工作中，首要任務仍然是對活性成分的分離鑒定.完成相關的成分的鑒定后，可結合國內外現有研究成果，縮小研究范圍.需要注意的是，應盡可能的對一些含量較低或未進行充分研究的成分進行藥理活性研究，避免漏掉關鍵活性成分.

3 討 論

從目前的相關文獻報道來看，鉤藤的提取工藝因為研究目的不同而呈現出一定的差異[37].以化合物的分離鑒定為目的研究，多以乙醇水溶液提取鉤藤總堿，而后進一步采用氯仿、乙酸乙酯等溶劑進行梯度洗脫的方式可提取、分離出多種生物堿類.將乙醇水溶液提取后酸化處理(pH值至2～3)后的不溶性成分用乙酸乙酯進行萃取可得非生物堿類成分，再經石油醚—醋酸乙酯梯度洗脫，可分離得到多種非生物堿類成分.

自鉤藤中提取分離帽柱木堿，可采用以下工藝：將粉碎后的鉤藤粉末用95%乙醇常溫浸提數次，合并提取液后，濃縮得到浸膏.向浸膏中加入一定濃度的鹽酸充分溶解，并將溶液pH值調整至2～3，抽濾得到濾液和酸不溶性成分.逐滴加入氨水，調整溶液pH，以氯仿—乙酸乙酯混合物梯度洗脫，將組分再經RP-18反相柱色譜洗脫即可分離到帽柱木堿.

鉤藤的成分較為復雜[40]，因此針對不同的成分的提取需要采取不同的方法.目前，對鉤藤藥用成分的提取方法主要有兩種：一種是用乙醇提取后，采用乙酸乙酯等脂溶性成分進行萃取，該方法提取得到的成分主要是脂溶性物質，例如鉤藤堿等；另一種是采用乙醇等成分進行提取，然后用乙醇進行萃取，該方法得到的是水溶性成分.國內對鉤藤堿、異鉤藤堿等成分研究得比較深入，相應的鉤藤堿、異鉤藤堿等成分的提取方法較為成熟.國外對絨毛鉤藤的藥用成分的研究多采用水—乙醇結合的方式進行提取，再結合超濾等技術除去大分子物質(鞣質、黃酮等).傳統中藥在應用過程中，多進行水煎，與國外的提取方法更為接近.

綜上所述，由于鉤藤活性成分具有廣泛的藥理活性，包括降血壓、心血管保護作用、神經保護作用等.因此，鉤藤水溶性提取成分所體現出來的鎮痛作用，其究竟是由多種活性成分共同作用導致的，還是由某種含量較低的成分(活性較強)所介導的，在后續工作中，需要進行大量深入細致的研究，才能進行確證.同時，由于鉤藤成分復雜，故而成熟、穩定的水溶性成分提取方法或許是能否成功分離出鎮痛活性成分的關鍵所在.