柚皮苷與順鉑聯用對骨肉瘤細胞增殖和遷移的影響

裴 祎，張曉晶，鄭 珂，王 巍，邱恩鐸，李盛龍

0 引言

骨肉瘤是青少年中最常見的原發惡性骨腫瘤，雖然發病率較低，但是由于其惡性程度高，預后差，多發于青少年，往往會給家庭和社會帶來極大的負擔。放化療技術未成熟時，對骨肉瘤的治療多采取高位截肢或者關節離斷術，不過仍有80%左右的患者由于肺轉移的原因導致生存期極短[1]。隨著各種新型輔助化療藥物的推廣，各種化療手段的應用，骨肉瘤的5年生存率顯著提高(60%～80%)。

阿霉素、甲氨蝶呤、順鉑和異環磷酰胺是目前最常見的骨肉瘤化療藥物。單個藥物治療骨肉瘤的效率不高，通常采用藥物聯用的方式，但是由于化療藥物本身的毒副作用，接受化療的患者生存質量往往較差，所以，有必要尋找新的藥物來與化療藥物聯合應用，以期降低化療藥物的使用濃度[2-5]。

柚皮苷(Naringin)屬于黃酮類化合物，是蕓香科植物中提取的單體，其廣泛存在于檸檬、葡萄汁和橘子等植物中。柚皮苷具有較強的清除自由基、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗炎和細胞保護作用，且可以抑制多種腫瘤的發生發展，但是在骨肉瘤中報道較少[6-8]。

本研究以人骨肉瘤細胞系MG63為研究對象，觀察柚皮苷聯合順鉑對MG63細胞增殖和侵襲轉移的抑制效果，對其作用機制進行初步探索，為臨床優化骨肉瘤的治療方案提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細胞株MG63(實驗室凍存)，1640培養基(Invitrogen，美國)，胎牛血清(天津灝洋，天津)，柚皮苷(Selleck，美國)，順鉑注射液(貴州漢方制藥有限公司，貴州)，四甲基偶氮唑藍MTT(碧云天，上海)，0.4 %臺盼藍(碧云天，上海)，抗體：cyclin d1、MMP2、GAPDH、二抗(Santa，美國)。

1.2 方法 細胞培養：將MG63細胞株用含10%胎牛血清的1640培養基(含50 IU/mL青霉素，50 IU/mL 鏈霉素)培養，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養至對數生長期。

藥物處理濃度順鉑為臨床常用的化療藥物，根據體表面積計算公式S=1.15+(m-30)0.1/5 (其中m>30 kg)計算出MTT所需藥物濃度，順鉑取中(1×PPC)濃度。參照參考文獻，柚皮苷取20 μg/mL濃度。空白對照組為NaCl處理組。

MTT實驗：取對數生長期MG63細胞，以2×104/mL濃度接種于96孔培養板中，終體積200 μL，細胞培養12 h貼壁后更換培養基，加入不同濃度藥物，各劑量組及對照組(NaCl處理組)分別設3個復孔。處理后的細胞于0、12、24、36、48 h分別加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃濕潤環境中溫育4 h，棄去孔中的培養基和MTT，在孔中各加入200 μL DMSO，以溶解殘留的MTT-甲臜結晶，置回37 ℃、5%CO2細胞培養箱中。15 min后，立即在490 nm處記錄吸光值。藥物對細胞的抑制率計算公式為：抑制率=1-(劑量組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。

Transwell實驗：以1×105每孔的密度將細胞

接種于上室中，下室添加600 μL雙無培養基，12 h后添加不同處理因素。藥物作用24 h后，95%乙醇固定，0.4 %臺盼藍染色。200倍顯微鏡下觀察。

Western blot實驗：RIPA裂解藥物處理24 h后的細胞，取40 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳(80～130 V)，轉膜(100 V，1 h)，5%脫脂奶粉封閉1 h后，一抗4 ℃過夜，二抗室溫1 h，洗膜發光。

1.3 統計學方法 采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，數據比較采用非配對t檢驗分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同處理因素對MG63細胞增殖的影響 分別采用5 μg/mL順鉑、20 μg/mL柚皮苷和5 μg/mL 順鉑+20 μg/mL柚皮苷聯合作用于MG63細胞上，隨后于不同時間點觀察藥物對細胞增殖的調節作用。結果顯示，柚皮苷能夠顯著提高順鉑對MG63細胞增殖的抑制作用。各組結果與對照組之間比較差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

2.2 不同處理組對MG63細胞周期蛋白的影響 如圖1所示，不同藥物處理時，順鉑和柚皮苷均可以在一定程度上抑制細胞周期相關蛋白cyclin d1，二者協同作用時，抑制作用更為明顯。

2.3 不同處理因素對MG63細胞遷移的影響 見圖2。分別采用5 μg/mL順鉑、20 μg/mL柚皮苷和5 μg/mL 順鉑+20 μg/mL柚皮苷聯合作用于MG63細胞上，隨后于不同時間點觀察藥物對細胞遷移的作用。結果顯示，柚皮苷能夠顯著提高順鉑對MG63細胞遷移的抑制作用。

圖1 不同藥物作用下細胞周期蛋白的變化

表1 順鉑、柚皮苷單獨使用以及聯合應用時對細胞增殖的抑制作用(%)

注：*與順鉑組比較，P<0.01；#與柚皮苷組比較，P<0.01

圖2 不同藥物作用下細胞遷移的變化

2.4 不同處理因素對MG63細胞遷移相關蛋白的影響 如圖3所示，不同藥物處理時，順鉑和柚皮苷均可以在一定程度上抑制細胞周期相關蛋白MMP2，二者協同作用時，抑制作用更為明顯。

圖3 不同藥物作用下細胞侵襲相關蛋白的變化

3 討論

骨肉瘤惡性程度很高，約有1/5的骨性腫瘤為骨肉瘤，好發于長骨的干骺端。股骨遠端、脛骨近端和肱骨近端尤其好發。約有近4/5的病例在確診骨肉瘤的時候已經有肺部微小轉移灶，肺轉移是骨肉瘤患者死亡的主要原因。近年來，隨著各種化療技術和小分子藥物等不斷研發，骨肉瘤患者的生存期也有所延長[9-15]。雖然化療藥物在很大程度上提高了骨肉瘤患者的生存率，但是由于骨肉瘤容易產生耐藥性，手術后的長期生存率仍然不高，并且順鉑等化療藥物具有很強的毒副作用，患者可能出現較為嚴重的消化道反應。因此，有必要尋找新的有效的藥物，配合或者取代化療藥物的使用，來提高骨肉瘤患者的生存質量。許多天然藥物提取物能夠對腫瘤起到治療作用，但是效果較差，可配合化療藥物使用。有報道，柚皮苷對乳腺癌、胃癌、肝癌、黑色素瘤等多種腫瘤細胞的生長有抑制作用[16-17]，其機制如下：通過影響Caspase-3的活性來調節HL-60的增殖與凋亡；通過調節黃曲霉素B參與腫瘤發生發展的調節；通過抑制PI3K/AKT通路的過度激活來抑制腫瘤的生物學功能，并且通過調節PI3K/AKT通路來提高腫瘤細胞對化療藥物的耐受性；通過調節TGF-β通路來影響腫瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲轉移。

本研究通過將柚皮苷與骨肉瘤治療的常見藥物順鉑聯合應用，檢測柚皮苷對骨肉瘤細胞增殖和遷移的調節作用。MTT和Transwell結果指出，順鉑可以顯著抑制骨肉瘤細胞MG63的增殖和遷移，并且Western blot實驗也發現順鉑對常見的細胞周期調控蛋白cyclin d1和侵襲轉移相關蛋白MMP2有一定的抑制作用。本實驗結果表明，柚皮苷可以通過抑制cyclin d1和MMP2來實現對MG63細胞增殖和遷移的抑制作用。二者聯合應用對MG63細胞的抑制作用顯著增強，其效果優于二者單獨應用，說明柚皮苷和順鉑聯合應用可以起到協同作用。

綜上所述，柚皮苷與順鉑聯合應用，可以降低順鉑治療骨肉瘤的使用濃度，進而減少順鉑化療的毒副作用，對提高膠質瘤的治療效果有一定的意義。同時柚皮苷是一種極具優勢和潛力的化療輔助藥物。

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