槲皮黃酮對Aβ誘導小神經膠質細胞損傷的保護機制研究

何 標，廉 果

0 引言

阿爾茨海默癥(Alzheimer′s disease，AD)是發生在老年前期及老年期的一種原發性退行性腦病，是一種持續性高級神經功能活動障礙，即在沒有意識障礙的狀態下，記憶、思維、分析判斷、視空間辨認、情緒等方面的障礙。研究顯示，在發生該病的機體腦部，存在大量激活的小神經膠質細胞，后者成簇地分布在β淀粉樣蛋白沉淀的周圍[1]，這些激活的小神經膠質細胞高度表達多種與免疫相關的受體蛋白，分泌大量生物活性分子[2]。在阿爾茨海默癥的發生發展過程中，會出現β淀粉樣蛋白(Aβ)斑塊沉積。而小神經膠質細胞則可以通過吞噬作用，幫助清除Aβ斑塊沉積。但是，在病癥加重或發病后期，小神經膠質細胞會釋放一些炎癥因子，加重炎癥反應，造成神經元的進一步損傷[3-5]。槲皮黃酮(Quercetin，Qu)是一種黃酮類化合物，來源于裸子植物、蕨類植物及被子植物的根莖部位[6]。近年研究表明，槲皮黃酮在臨床上的應用越來越受到關注，因其抗氧化和抗炎癥反應的效果頗為顯著，還可用于神經系統疾病、癌癥、糖尿病引起的多種并發癥及肥胖癥等[7-9]。因此，本文通過體外構建阿爾茨海默癥細胞模型，觀察槲皮黃酮對β-淀粉樣蛋白誘導小神經膠質細胞(BV-2)損傷的保護作用，并對其作用機制進行了初步研究。

1 材料及方法

1.1 材料 小神經膠質細胞(BV-2，上海復祥生物科技有限公司)；槲皮黃酮(Sigma，CAS No.117-39-5，≥99%)；CCK8試劑盒(上海博谷生物科技有限公司)；ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(巴菲爾生物技術有限公司，批號：131221)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海谷歌生物有限公司，批號：P0010S-01)；DMEM高糖培養基(武漢谷歌生物科技有限公司)；胎牛血清(Gibco公司)；胰蛋白酶(武漢谷歌生物科技有限公司)；β-actin、β-分泌酶(BACE)、早老素(PS1)、呆蛋白(NCT)、NEP、IDE一抗均購自美國Sigma公司；二抗羊抗兔IgG購自武漢谷歌生物有限公司。

1.2 儀器 DNM-9602G型酶標儀(北京普朗新技術有限公司)；單人超凈臺(蘇州華新空調凈化有限公司)；細胞培養箱(上海醫用分析儀器廠)；凝膠電泳儀(北京六一儀器廠)；雙色紅外激光成像系統(BIO-RAD，美國)。

1.3 BV-2細胞復蘇、傳代培養 預先對超凈工作臺及相關實驗用品進行紫外消毒30 min，將凍存于液氮中的BV-2細胞迅速取出，置于37 ℃溫水浴中不斷搖晃，使其在1 min內快速溶解，離心后置于超凈工作臺上，棄去上清，加入新的DMEM完全培養基(10% FBS，1%雙抗)重懸細胞，分裝于3個培養瓶，搖勻使細胞分散均勻后，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養。待細胞貼壁生長到90%左右時，便可傳代培養，所有操作均在超凈工作臺上完成。取出細胞，用復溫的PBS溶液清洗細胞2遍，加入胰蛋白酶進行消化，在顯微鏡下觀察，待細胞變圓后，加入培養基終止消化，吸出細胞懸液于Ep管中，離心，再重懸細胞后，以1∶3的比例進行傳代培養，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養。

1.4 CCK8試驗 將對數生長期的BV-2細胞進行消化、重懸、計數后，取適量數量的細胞接種于96孔板中，每孔終體積為200 μL，每組設置6個復孔。待細胞貼壁生長至80%左右時，取出棄去舊培養基，加入含不同濃度槲皮黃酮(10、20、40 μg/mL)的高糖培養基，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中繼續孵育24 h。棄去舊培養基，每孔加10 μL CCK8試劑，重新放置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養1 h后，置于酶標儀中于450 nm波長處檢測吸光度(OD)值，并計算細胞相對存活率。

1.5 ELISA試驗 將對數生長期的BV-2細胞進行消化、重懸、計數后，取適量數量的細胞接種于6孔板中，每孔終體積為2 mL，每組設置6個復孔。待細胞貼壁生長至80%左右時，吸棄舊培養基，加入含低、中、高劑量槲皮黃酮(10、20、40 μg/mL)的高糖培養基，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中繼續孵育24 h，收集細胞培養基上清及細胞。細胞培養基上清用于炎癥因子IL-6、TNF-α檢測，具體操作步驟根據ELISA試劑盒操作說明書進行。

1.6 免疫印跡檢測蛋白表達水平 將“1.5”項收集的細胞用RIPA裂解液在冰上裂解，待裂解完全后，在預冷的低溫離心機中離心(12 000 r/min，12 min)，吸取上清并記錄體積，加入1/4體積的蛋白上樣緩沖液，于100 ℃煮沸7 min。并同時采用BCA試劑盒對蛋白濃度進行檢測，計算上樣體積。每孔上樣量為30 μg蛋白，濃縮膠采用的恒壓為70 V，分離膠采用的恒壓為120 V，離膠底部1～2 cm停止電泳。采用275 mA恒流進行電轉，時間為90 min。采用5%脫脂奶粉封閉，將膜用TBS清洗后置于相應盛裝抗體的盒子中，4 ℃孵育過夜；TBST清洗膜3次，室溫下孵育二抗。利用Odyssey近紅外掃描儀對β-actin、BACE、PS1、NCT、NEP、IDE表達水平進行檢測。

2 結果

2.1 槲皮黃酮對BV-2細胞增殖的影響 采用CCK8試劑對BV-2細胞的增殖情況進行檢測，結果如圖1a所示，模型組中BV-2細胞經過Aβ刺激后，細胞的相對存活率低于正常對照組(P<0.05)。低、中、高劑量槲皮黃酮處理后，BV-2細胞的相對存活率高于模型組(P<0.05)，并且隨著槲皮黃酮劑量的增加，相對存活率升高越明顯，表現出濃度依賴性。同時，采用中劑量槲皮黃酮對細胞處理0、12、24、48、72 h，發現隨著藥物作用時間延長，細胞相對存活率越高，見圖1b。

圖1 槲皮黃酮對BV-2細胞增殖的影響(n=6)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

1.正常對照組，2.模型組，3.槲皮黃酮10 μg/mL組，4.槲皮黃酮20 μg/mL組，5.槲皮黃酮40 μg/mL組

2.2 槲皮黃酮對炎癥因子IL-6、TNF-α表達水平的影響 低、中、高劑量槲皮黃酮作用BV-2細胞24 h后，藥物對細胞分泌炎癥因子IL-6、TNF-α水平的影響如圖2所示。模型組細胞培養基上清中IL-6、TNF-α的含量高于正常對照組(P<0.05)。經過不同劑量槲皮黃酮處理后，細胞上清液中IL-6、TNF-α的表達水平低于模型組(P<0.05)；隨著槲皮黃酮劑量的升高，IL-6、TNF-α含量的下降越明顯，表現出濃度依賴性。

2.3 槲皮黃酮對BACE、PS1、NCT、蛋白表達水平的影響 采用Western blot檢測BV-2細胞中BACE、PS1、NCT蛋白表達，見圖3。模型組細胞BACE、PS1、NCT蛋白表達水平高于正常對照組(P<0.05)。低、中、高劑量槲皮黃酮組BACE、PS1、NCT蛋白表達水平低于模型組(P<0.05)，并且隨著藥物濃度增加，其蛋白表達水平降低越明顯，表現出濃度依賴性。

2.4 槲皮黃酮對腦啡肽酶(NEP)、胰島素降解酶(IDE)表達水平的影響 采用免疫印跡技術對BV-2細胞中NEP及IDE蛋白檢測結果如圖4所示，模型組細胞經過Aβ刺激后，NEP及IDE蛋白表達水平相對于正常對照組而言顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。而經過低、中、高劑量槲皮黃酮處理后，NEP及IDE蛋白表達水平相對于Aβ刺激組顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，并且隨著藥物濃度增加顯著性越明顯，表現出濃度依賴性。

圖2 槲皮黃酮對BV-2細胞分泌炎癥因子的影響(n=6)

圖3 槲皮黃酮對BACE、PS1及NCT蛋白表達水平的影響(n=6)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

1.正常對照組，2.模型組，3.槲皮黃酮10 μg/mL組，4.槲皮黃酮20 μg/mL組，5.槲皮黃酮40 μg/mL組

圖4 槲皮黃酮對NEP及IDE蛋白表達水平的影響(n=6)

3 討論

BV-2細胞是中樞神經系統內具有免疫活性的巨噬樣細胞，其聚集在β淀粉樣蛋白斑塊周圍，這些活化的BV-2細胞能夠過度表達多種與免疫相關的受體蛋白，參與阿爾茨海默癥的發生、發展[10]。有報道，TNF-α對神經元細胞及小神經膠質細胞具有重要的調節作用，其能夠增強小神經膠質細胞的吞噬功能，分泌前炎癥細胞因子和抗炎性細胞因子，影響神經元膜電位、細胞內鈣離子平衡和長時程增強，并可以協調IL-1誘導IL-6的產生[11]。IL-6是一種具有破壞性的前炎癥細胞因子，可以介導中樞神經系統的免疫及炎癥反應，引起細胞功能異常。細胞內β淀粉樣蛋白的沉積及小神經膠質細胞活化產生的炎癥反應均是阿爾茨海默癥的發病機制[12]，因此，減少小神經膠質細胞內β淀粉樣蛋白沉積及炎癥反應，可能是治療阿爾茨海默癥的一種方式。

采用Aβ誘導可較好地構建BV-2細胞損傷模型，經過低、中、高3種劑量的槲皮黃酮處理后，BV-2細胞的相對存活率相對于Aβ誘導模型組顯著增加。藥物處理后，可明顯降低炎癥因子IL-6及TNF-α的表達水平。并且槲皮黃酮可以明顯降低BACE、PS1及NCT蛋白表達水平，說明槲皮黃酮可以抑制Aβ合成酶的表達及與老年癡呆相關蛋白的表達；同時，槲皮黃酮還可以促進Aβ消化酶NEP及IDE的表達，說明槲皮黃酮可以促使Aβ降解，減少其在小神經膠質中的沉積。

綜上所述，槲皮黃酮對Aβ誘導的BV-2細胞損傷具有保護作用，其作用的機制可能與抑制Aβ分泌酶表達和激活Aβ消化酶表達相關。

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