復(fù)方丹參黏附微丸對黏膜刺激性研究

趙夢迪，黎丹奇，陳笑南，喻剛艷，白 潔，李鵬躍，陸 洋，杜守穎

0 引言

將現(xiàn)代新型制劑技術(shù)用于傳統(tǒng)名方，是中藥現(xiàn)代化的一條重要途徑。復(fù)方丹參方是臨床治療冠心病的名優(yōu)處方。近年文獻報道，復(fù)方丹參制劑可引起不良反應(yīng)[1-3]。胃腸不良反應(yīng)是口服復(fù)方丹參制劑的常見不良反應(yīng)之一[4-5]，可能是因為方中佐使藥冰片藥性寒涼，久服可能傷胃。相關(guān)動物實驗也表明，冰片大劑量或者長期服用時會刺激胃黏膜，造成胃部不適[6]。本課題組前期用β-環(huán)糊精包合佐使藥冰片，采用現(xiàn)代技術(shù)，將名優(yōu)處方復(fù)方丹參方制成黏附微丸，增加藥物在胃腸道的停留時間，以期提高其生物利用度。但是，黏附微丸中的黏附材料在胃腸道停留時間較長，也有可能造成黏膜刺激性，因此，本實驗以冰片不包合的黏附微丸和普通復(fù)方丹參黏附微丸為參比，考察黏附材料是否會對黏膜產(chǎn)生刺激性以及復(fù)方丹參黏附微丸中冰片經(jīng)包合后，是否能降低對胃腸道的刺激。

1 材料

1.1 儀器與試劑 自制灌胃器，勻漿機(常州恒隆儀器有限公司)，臺式高速冷凍離心機(上海天美生化儀器設(shè)備有限公司)，Multiskan Go型酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher)，96孔板(美國Corning Iocorporated)，手術(shù)剪及鑷子，OLYMPUS BX51型顯微鏡(日本)。普通復(fù)方丹參微丸，復(fù)方丹參冰片包合黏附微丸，復(fù)方丹參冰片不包合黏附微丸，空白黏附微丸(以上制劑均為實驗室自制，批號：20160612)。純凈水(娃哈哈集團有限公司)，PBS溶液(索萊寶)，氯化鈉(西隴化工股份有限公司，AR分析純)，LDH試劑盒(南京建成)，MDA試劑盒(碧云天)，脫氧膽酸鈉(索萊寶)。

1.2 動物 SPF級的SD雄性大鼠45只，體重240～260 g [北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2012-0001]。中華大蟾蜍36只，體重40～50 g (江蘇振興蟾業(yè))。

2 實驗方法

2.1 體外實驗[7]體外蟾蜍上顎纖毛毒性實驗方法：取蟾蜍36只，隨機分為6組：空白對照組(KB)，陽性對照組(SD)，普通復(fù)方丹參制劑組(PT)，復(fù)方丹參冰片不包合黏附微丸組(NBNF)，復(fù)方丹參冰片包合黏附微丸組(BNF)，空白黏附微丸組(CL)，每組6只。除空白對照組和陽性對照組，其余組別給藥量為藥物粉末0.5 g/只。

將蟾蜍仰臥并固定于蛙板上，用止血鉗使其口腔張開，防止其閉合和吞咽。同時，將各組藥物分別用少量水潤濕，空白對照組滴加0.5 g生理鹽水，陽性對照組滴加0.5 g的1%去氧膽酸鈉溶液，其余組別給藥量為相應(yīng)微丸粉末0.5 g/只。將藥粉平鋪于蟾蜍上顎，滴加適量水浸潤藥物，給藥0.5 h后，用生理鹽水沖凈藥物。然后用眼科剪和眼科鑷分離上顎黏膜，取約大小5 mm×5 mm的黏膜，黏膜分離后立即用生理鹽水洗去血污及雜物。將取得的黏膜纖毛面向上平鋪于載玻片上，于黏膜表面滴加少量生理鹽水使之浸潤，輕輕蓋上蓋玻片，于光學(xué)顯微鏡下觀察纖毛運動情況。每次觀察完畢，立即將黏膜置于預(yù)先用少量蒸餾水飽和的培養(yǎng)皿中，密閉，環(huán)境溫度為25 ℃。每隔適當(dāng)?shù)臅r間取出上顎標(biāo)本，于光學(xué)顯微鏡下觀察，如纖毛持續(xù)運動，則放回培養(yǎng)皿中，直至纖毛停止運動。

記錄從開始給藥到纖毛停止運動的時間，即纖毛持續(xù)運動時間(Persistent vibration duration，PVD)。通過比較PVD值，評價不同制劑對上顎纖毛的毒性，PVD越長，表明毒性越小。

2.2 體內(nèi)方法 45只大鼠隨機分為5組：空白對照組(KB)，普通復(fù)方丹參微丸組(PT)，復(fù)方丹參冰片不包合黏附微丸組(NBNF)，復(fù)方丹參冰片包合黏附微丸組(BNF)，空白黏附微丸組(CL)，每組9只。各組大鼠均采用灌胃給藥，給藥量為2.4 g/(kg·d)。每組大鼠隨機平均分為3批，第1批給藥1周后立即處死，第2批給藥2周后立即處死，第3批給藥4周后立即處死。大鼠處死后觀察胃、腸黏膜變化，并對其胃、腸黏膜進行病理切片觀察，以及MDA、LDH試劑盒檢測。

2.2.1 大鼠病理切片評價 分別于灌胃給藥后1、2、4周后脫頸椎處死大鼠，解剖獲取大鼠胃、腸黏膜，觀察胃、腸黏膜是否出血，是否有非正常分泌物、結(jié)構(gòu)層次是否清晰等，然后將大鼠胃、腸黏膜用10%的甲醛固定，經(jīng)取材、固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、貼片以及HE染色和封片操作制成胃、腸黏膜病理切片，光鏡下觀察胃黏膜的層次結(jié)構(gòu)、炎細(xì)胞浸潤程度等。

2.2.2 胃、腸黏膜氧化損傷及細(xì)胞毒性測試 各組大鼠于灌胃給藥2、4周后脫頸椎處死，解剖獲取10%胃、10%腸組織勻漿，按MDA、LDH試劑盒方法測定胃、腸組織中MDA含量和LDH含量。

3 實驗結(jié)果

3.1 體外評價結(jié)果 各組在體蟾蜍上顎纖毛毒性實驗結(jié)果：與KB組比較，PVD結(jié)果如圖1。在體蟾蜍上顎黏膜纖毛毒性觀察結(jié)果見圖2，KB組上顎纖毛清晰，完整，擺動活躍；SD組觀察到蟾蜍纖毛不清晰，無運動狀態(tài)；CL組、BNF組、NBNF組、PT組均能觀察蟾蜍上顎纖毛清晰，擺動活躍，如圖2。

通過對各組藥物對蟾蜍上顎黏膜纖毛運動時間影響的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，SD組PVD小于KB組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其余各組PVD略小于空白對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，3種復(fù)方丹參黏附微丸組的PVD值雖略有變化，但各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明，本課題組制備的復(fù)方丹參黏附微丸中的黏附材料和各種復(fù)方丹參微丸對胃腸道無顯著刺激性。

3.2 體內(nèi)評價部分

3.2.1 病理切片及結(jié)果 脫頸椎處死大鼠后，解剖觀察大鼠胃、腸黏膜，各組大鼠胃、腸黏膜均無充血現(xiàn)象，沒有觀察到明顯的異常分泌物，顏色鮮亮粉嫩，未見纖維增生，未見泡狀細(xì)胞增生，而且層次結(jié)構(gòu)清晰。圖3～圖14分別為連續(xù)給藥1、2、4周后大鼠的胃、腸黏膜病理切片圖。

圖1 蟾蜍上顎纖毛運動時間(PVD)

圖2 各組給藥 30 min 后蟾蜍上顎纖毛結(jié)構(gòu)(400×)

圖3 連續(xù)給藥1周的胃黏膜病理切片圖(100×)

圖4 連續(xù)給藥1周的胃黏膜病理切片圖(400×)

圖5 連續(xù)給藥1周的腸黏膜病理切片圖(100×)

圖6 連續(xù)給藥1周的腸黏膜病理切片圖(400×)

圖7 連續(xù)給藥2周的胃黏膜病理切片圖(100×)

圖8 連續(xù)給藥2周的胃黏膜病理切片圖(400×)

圖9 連續(xù)給藥2周的腸黏膜病理切片圖(100×)

圖10 連續(xù)給藥2周的腸黏膜病理切片圖(400×)

圖11 連續(xù)給藥4周的胃黏膜病理切片圖(100×)

圖12 連續(xù)給藥4周的胃黏膜病理切片圖(400×)

圖13 連續(xù)給藥4周的腸黏膜病理切片圖(100×)

由顯微鏡(100×)可知，連續(xù)給藥1、2、4周后，與KB組比較，CL、NBNF、BNF、PT組大鼠胃、腸黏膜無明顯改變，結(jié)構(gòu)層次完整、清晰；由顯微鏡(400×)可知，連續(xù)給藥1、2、4周時，與KB組比較，CL、NBNF、BNF、PT組大鼠胃、腸黏膜均無明顯改變，未見纖維增生，也未見炎細(xì)胞浸潤和泡狀細(xì)胞增生。結(jié)果表明，連續(xù)給藥1、2、4周后，黏附材料及復(fù)方丹參黏附均無明顯刺激性。

3.2.2 胃、腸組織氧化損傷及細(xì)胞毒性測試結(jié)果 由表1、表2可見，連續(xù)給藥2、4周后，CL、NBNF、BNF、PT組胃腸的MDA、LDH濃度與KB組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明黏附材料并未對胃腸道造成顯著刺激，冰片包合/不包合復(fù)方丹參黏附微丸對胃腸道也無顯著刺激性。

4 討論

蟾蜍上顎纖毛毒性實驗結(jié)果顯示，顯微鏡下空白黏附微丸、普通復(fù)方丹參微丸、復(fù)方丹參冰片包合黏附微丸、復(fù)方丹參冰片不包合黏附微丸組均能看到清晰纖毛，且擺動活躍，PVD比較結(jié)果顯示，各微丸組PVD略低于空白對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。通過大鼠胃、腸黏膜肉眼觀察、病理切片、氧化損傷及細(xì)胞毒性測試實驗，可發(fā)現(xiàn)本實驗所考察的空白黏附微丸及3種復(fù)方丹參微丸均未改變大鼠胃、腸黏膜表面形態(tài)，未見纖維增生，也未見炎細(xì)胞浸潤和泡狀細(xì)胞增生等病理變化。分析可能主要存在2個原因：①復(fù)方丹參制劑中的冰片含量不大，黏膜對此劑量不敏感，有報道，服用復(fù)方丹參制劑產(chǎn)生刺激性，可能是少數(shù)的個別體質(zhì)原因；②服用時間較短，本實驗對大鼠灌胃給藥1個月，低劑量冰片長期服用可能會造成輕微刺激性，這有待進一步考察。實驗結(jié)果顯示，復(fù)方丹參黏附微丸中所用黏附材料及用量比例，對胃、腸黏膜沒有顯著刺激性，復(fù)方丹參冰片不包合黏附微丸及復(fù)方丹參冰片包合微丸對大鼠胃、腸道也無顯著刺激，以上實驗結(jié)果為復(fù)方丹參黏附微丸的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。

表1 給藥后胃、腸組織MDA濃度(μmol/L)

表2 給藥后胃、腸組織LDH濃度(μmol/L)

刺激性評價多為外用制劑或鼻腔給藥劑型的重要評價內(nèi)容，口服制劑的胃腸道刺激性研究較少，本課題前期針對復(fù)方丹參制劑中冰片性寒，有可能存在黏膜刺激性的問題，采用β-環(huán)糊精冰片包合，一方面可以減少對人體的刺激性；另一方面又可以提高冰片在制劑中的穩(wěn)定性[8]。為了提高藥物的生物利用度，課題組在實驗前期對不同黏附材料及用量進行了考察，將復(fù)方丹參方制備成黏附微丸[9]，并對處方中冰片體外溶出行為進行了對比研究[10]。

本研究結(jié)果表明，復(fù)方丹參黏附微丸中黏附材料及冰片包合前后制備的復(fù)方丹參黏附微丸對胃、腸黏膜無顯著性刺激，為復(fù)方丹參方新劑型的開發(fā)提供參考。

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