甘蔗皮原花青素的提取及抗氧化活性研究

侯巧芝，吳建麗，張爽爽

(黃河科技學院 醫學院，鄭州 450063)

原花青素(Procyanidins，簡稱PC)是一類黃烷醇單體及其聚合體形成的多酚類物質，具有抗氧化、清除自由基等多種生理活性[1]。作為食品添加劑具有防腐、抗氧化等多重功效。甘蔗是我國制糖工業的主要原料之一，作為副產物的甘蔗皮含有大量的天然色素、蛋白質和纖維等物質，若能有效地開發利用能大大提高農產品的附加值[2]，同時有利于資源的循環利用。查閱文獻發現對甘蔗皮中原花青素的提取工藝及性質的研究鮮有報道[3]。本研究利用超聲輔助通過單因素考察和正交試驗確定甘蔗皮的原花青素提取的最佳工藝，并考察原花青素粗提液的總抗氧化性能。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料

甘蔗皮：鄭州市農貿市場購買。

TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；XFB-200粉碎機 吉首市中誠制藥機械廠；7230G可見分光光度計 上海永光精密儀器有限公司；干燥箱、藥典篩、分析天平、托盤天平、超聲波清洗器、恒溫水浴鍋。

無水乙醇、濃鹽酸、香草醛粉末、丙酮、甲醇、原花青素標準品：以上試劑均為AR級，購于上海阿拉丁試劑網。

1.2 甘蔗皮原花青素的提取工藝

1.2.1 甘蔗皮原花青素主要提取流程

甘蔗皮清洗→烘干→粉碎→過篩→提取→粗濾液→測其吸光度。

1.2.2 溶劑的選擇

取1 g甘蔗皮粉末9份于9支錐形瓶中，分別加入純的甲醇、乙醇和丙酮10 mL各3份于錐形瓶中，再各自加入10 mL蒸餾水，在溫度50 ℃，浸泡時間30 min和超聲時間30 min后抽濾，各自加入相同量的香草醛-硫酸顯色劑于532 nm處測吸光度。結果發現丙酮溶解性最好，乙醇次之，但考慮綠色化試驗及實際的應用，本試驗選用乙醇作為溶劑。

1.2.3 波長的確定

取1 g甘蔗皮粉末于錐形瓶中，加入60%乙醇，超聲30 min，水浴鍋50 ℃加熱20 min后，抽濾，加入顯色劑在400～800 nm進行波長掃描，在532 nm處有最大吸收，故本試驗甘蔗皮中提取原花青素波長定為532 nm。

1.2.4 原花青素標準曲線的繪制

精密稱取原花青素標準品300 mg于50 mL容量瓶中用蒸餾水定容，超聲30 min后抽濾，再分別量取0，1.0，3.0，5.0，7.0，9.0 mL于10 mL容量瓶中用蒸餾水定容，加入顯色劑搖勻，在532 nm處測吸光度A，得到的線性回歸方程為 y=0.17742x+0.00293，R=0.9992，在濃度0.4～3.2 mg/mL范圍內線性關系良好。

1.2.5 甘蔗皮中原花青素提取率的計算

提取率=C×V×n/m。

式中：C為根據標準曲線得出不同吸光度A所對應的原花青素的濃度，mg/mL；V為測定提取液的原始體積，mL；n為稀釋的倍數；m為甘蔗皮粉末的質量，g。

1.3 試驗方法

1.3.1 甘蔗皮中原花青素的提取

取1.0 g甘蔗皮粉末按料液比1∶30加入體積分數為60%的乙醇水溶液30 mL，于50 ℃水浴鍋中浸泡30 min后超聲30 min。抽濾后加入顯色劑，于532 nm處測其吸光度，并計算提取率。

1.3.2 單因素試驗

在1.3.1項條件下進行試驗，保證其他條件相同的情況下改變其中的一個條件，分別考察料液比[1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 (g/mL)]、超聲時間(10，20，30，40，50，60 min)、溫度(10，20，30，40，50，60 ℃)、乙醇體積分數(0，30%，40%，50%，60%，70%)和浸泡時間(30，40，50，60，70，80 min)對提取率的影響。

1.3.3 正交試驗

單因素試驗選取料液比、超聲時間、溫度、浸泡時間為考察對象進行四因素三水平正交試驗，見表1。

表1 L9(34)正交試驗因素水平Table 1 L9(34) orthogonal experimental factors and levels table

1.3.4 總抗氧化活性試驗——FRAP法[4]

FRAP法基于Fe3+-三吡啶三吖嗪(trypyridyl-s-triazine，簡寫為TPTZ)螯合物在酸性環境下被還原為Fe2+-TPTZ螯合物后呈現明顯的藍色，該螯合物在593 nm處具有最大吸收。通過檢測藍色產物的生成量可反映待測原花青素樣品的還原能力。

1.3.4.1 FeSO4標準曲線

準確稱取FeSO4111.2 mg溶于水中，加入18 mol/L硫酸0.25 mL再加水稀釋至50 mL定容，并置入小鐵釘。取上述溶液5 mL于50 mL容量瓶中，定容至50 mL，即為800 μmol/L FeSO4標準溶液。預先用小試管裝5 mL水，取5 mL FeSO4(800 μmol/L)標準溶液加入試管中，制得400 μmol/L標準溶液，按此方法依次進行，制得0，100，200，300，400，500，600，700，800 μmol/L的FeSO4標準溶液。取不同濃度的FeSO4標準溶液0.2 mL，加入1.8 mL FRAP 工作液，混勻后于37 ℃反應10 min，593 nm處測定吸光度，制定還原力標準曲線。

1.3.4.2 總抗氧化能力測定

移取原花青素粗提液稀釋至不同濃度，準確加入6 mL的FRAP，再加入600 μL的超純水混勻后置于37 ℃水浴鍋中放置10 min，于593 nm處測其吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對提取率的影響

圖1 料液比對提取率的影響Fig.1 The effect of solid-liquid ratio on extraction yield

由圖1可知，提取率隨著料液比先增后減，料液比為1∶10，1∶20，1∶30時提取率較高，波動較大；1∶40，1∶50對提取率影響不太明顯，所以選料液比為1∶10，1∶20，1∶30作為正交試驗的條件。又因1∶10，1∶20需稀釋倍數較大，所以超聲時間、溫度等單因素試驗均采用1∶30料液比作為條件。

2.1.2 超聲時間對提取率的影響

圖2 超聲時間對提取率的影響Fig.2 The effect of ultrasonic time on extraction yield

由圖2可知，超聲時間對提取率的影響呈現先增后減的趨勢，30 min提取率達最大，原因可能與超聲時間短原花青素溶出不完全，超聲時間長且在高溫的狀態下原花青素的結構發生變化有關[5]。據此，正交試驗超聲時間選取20，30，40 min。

2.1.3 溫度對提取率的影響

圖3 溫度對提取率的影響Fig.3 The effect of temperature on extraction yield

由圖3可知，溫度對原花青素的提取率有較大的影響，溫度為50 ℃時為最佳提取工藝溫度，所以選取提取率相對較大的50，60，70 ℃作為正交試驗的3個水平。

2.1.4 乙醇體積分數對提取率的影響

圖4 乙醇體積分數對提取率的影響Fig.4 The effect of ethanol volume fraction on extraction yield

由圖4可知，乙醇體積分數對原花青素的提取率影響不是很大，整體幅度較平緩，乙醇體積分數為40%時提取率最大，所以本試驗的乙醇體積分數定為40%，乙醇體積分數不作為正交試驗的考察因素。

2.1.5 浸泡時間對提取率的影響

圖5 浸泡時間對提取率的影響Fig.5 The effect of soaking time on extraction yield

由圖5可知，隨著浸泡時間的增加，提取率呈現先上升后下降的趨勢，浸泡時間50 min時提取率達最大，原因可能與花青素的結構變化有關。所以選取正交試驗的3個水平為30，40，50 min。

2.2 正交試驗

表2 L9(34)正交試驗因素水平結果Table 2 The results of L9(34) orthogonal experiment

由表2可知，各因素影響主次順序為：料液比>超聲時間>溫度>浸泡時間，最優水平為A3B2C1D3，即料液比為1∶30 (g/mL)，超聲時間為30 min，溫度為50 ℃，浸泡時間為50 min。

2.3 驗證性試驗

為了驗證正交試驗結果，采用上述最佳工藝條件進行甘蔗皮原花青素提取試驗，即料液比1∶30 (g/mL)，超聲時間30 min，溫度50 ℃，浸泡時間50 min，乙醇的體積分數40%，實際測得的提取率平均值為23.15 mg/g，RSD值為0.8%，與正交試驗最佳結果基本相同。表明正交試驗所得最佳工藝條件準確可行。

2.4 抗氧化活性試驗

2.4.1 FeSO4標準曲線

圖6 FeSO4標準曲線Fig.6 The standard curve of FeSO4

由圖6可知，FeSO4濃度在 0.084～0.794 mmol/L范圍內與吸光度A值線性關系良好，線性回歸方程為y=0.9732x+0.2328，相關系數 R=0.9994。 因此以FRAP法在593 nm 處測定甘蔗皮中原花青素吸光度值，據此換算成FeSO4當量濃度的方法是可行的。

2.4.2 總抗氧化能力測定

把測得不同濃度粗提液的吸光度值代入2.4.1項下FeSO4標準曲線換算成FeSO4當量濃度，結果見圖7。

圖7 總抗氧化能力測定曲線Fig.7 Total antioxidant capacity measurement curve

由圖7可知，隨著甘蔗皮原花青素粗提液濃度的增加，其抗氧化活性增大，趨勢呈線性關系，線性相關方程為y=0.185x-0.2398，相關系數R=0.9991，擬合程度良好。

3 結語

本試驗采用超聲輔助通過單因素試驗和正交試驗確定了原花青素提取的最佳工藝條件為料液比1∶30 (g/mL)，超聲時間30 min，溫度50 ℃，浸泡時間50 min，乙醇體積分數40%，平均提取率為23.15 mg/g。抗氧化試驗結果表明原花青素的抗氧化活性隨著濃度的增大呈線性增強。該研究為甘蔗皮中原花青素的進一步研究提供了理論依據。

[1]金華,劉志剛,曾曉丹,等.超聲提取葡萄籽原花青素工藝的優化及其抗氧化活性研究[J].中國調味品,2014,39(4):102-107.

[2]韋相貴,何永玲,侯昭武,等.甘蔗皮的保健功能及其產品開發研究[J].時珍國醫國藥,2013,24(4):933-935.

[3]何雄,周靜峰,師邱毅,等.甘蔗皮花色苷的提取工藝及穩定性初探[J].食品工業科技,2011,32(12):371-373,376.

[4]楊皓彬,楊娜,柏雪,等.白茶中茶多酚提取工藝及抗氧化活性的研究[J].中國食品學報,2014(12):24-31.

[5]田琳,孔繁東,劉兆芳,等.短梗刺五加籽原花青素的提取工藝[J].中國調味品,2014,39(5):102-104.