響應面優化超聲輔助提取桂皮總黃酮的工藝研究

趙世霞

(淄博職業學院，山東 淄博 255314)

桂皮，別名官桂或香桂，為天竺桂、肉桂或川桂等樟科植物樹皮的通稱[1,2]，在我國主要產于云南、廣西等地。桂皮是典型的食藥同源品種[3]，作為傳統的中藥材，其具有暖胃祛寒、通脈止痛、散瘀消腫、止瀉、活血舒筋等功效；作為古老的香辛調味品，其廣泛用于肉類菜肴的祛腥解膩及五香粉的加工[4]。現代藥理學實驗表明桂皮含有揮發油、多糖類、皂苷類、萜類、酚類、黃酮類等多種化學活性物質，在消化、心血管、免疫及內分泌相關疾病的預防和治療中發揮著重要作用[5]。近年來，隨著人們對健康的重視，作為桂皮主要成分之一的黃酮類化合物由于具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、增強免疫力等作用而受到國內外學者及大型公司的廣泛 關注，其在藥品、保健食品、食品添加劑、功能性飲料、消毒劑等領域極具開發價值[6,7]。

目前，黃酮類化合物的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、微波或超聲輔助提取法、有機溶劑提取法等[8]。超聲輔助提取具有效率高、質量穩定、安全性高、耗能低等特點，近年來被廣泛應用于活性物質的提取[9,10]。本研究選用乙醇作為提取溶劑，采用超聲輔助提取法對桂皮總黃酮化合物的提取工藝進行優化，以期為桂皮的二次開發提供一定的思路與理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桂皮：市售，經洗凈、烘干、粉碎后過60目篩備用；蘆丁標準品：酷爾化學科技有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉：均為國產分析純。

1.2 儀器

DHG-9145A型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；HZY-C500型電子天平 河南兄弟儀器設備有限公司；UV-5100B型紫外分光光度計 無錫久平儀器有限公司；FW135型中草藥粉碎機 北京中興偉業儀器有限公司；RE-52A型旋轉蒸發儀 江蘇同君儀器科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 總黃酮含量的測定

以蘆丁為標準品，采用比色法測定510 nm處吸光度[11]。以質量濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線，A=9.3971C-0.0039，R2=0.9988。利用標準曲線計算樣品總黃酮含量，桂皮中總黃酮提取率按下式計算：

總黃酮提取率=(提取總黃酮的質量/桂皮粉末質量)×100%。

1.3.2 桂皮總黃酮的提取

精確稱取桂皮干燥粉末10.00 g，按一定液料比(mL/g)15∶1加入60%的乙醇溶劑，在600 W額定超聲功率下提取 60 min，提取液冷卻后過濾，濾液減壓濃縮至30～40 mL，過0.45 μm濾膜，轉移至100 mL容量瓶中，60%乙醇定容，搖勻后取1 mL提取液測定總黃酮含量，計算提取率。

1.3.3 單因素試驗

單因素試驗按1.3.2步驟進行桂皮總黃酮的提取，分別以不同的液料比(mL/g)10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，不同乙醇濃度40%，50%，60%，70%，80%，90%，不同超聲功率300，400，500，600，700，800 W，不同提取時間20,40,60,80,100 min為單因素，考察單因素對桂皮總黃酮提取的影響，試驗重復3次。

1.3.4 響應面優化試驗

根據單因素試驗結果，采用Box-Benhnken試驗設計對桂皮總黃酮的提取工藝進行響應面優化，試驗設計見表1，試驗重復3次。

2 結果

2.1 單因素優化試驗

圖1 單因素條件對桂皮總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of single factor on the extraction rate of flavonoids from cinnamon

由圖1中A可知，桂皮總黃酮提取率隨著液料比的增加呈典型的倒“V”型變化趨勢，當液料比為20∶1時，提取桂皮總黃酮的效果最佳。這是因為液料比低時，桂皮粉末得不到充分浸潤；增加液料比，黃酮類化合物的擴散和溶出速率的提高有利于桂皮總黃酮的提取；液料比過高時，非黃酮類可溶雜質溶出增加，導致桂皮總黃酮提取率下降。因此，選擇液料比20∶1較為合適。由圖1中B可知，桂皮總黃酮提取率隨著乙醇濃度的增加而快速增加，當乙醇濃度為70%時，桂皮總黃酮提取率最大，達到4.52%，隨后桂皮總黃酮提取率開始下降。這是由于隨著乙醇體積分數增大，提取液極性開始下降，黃酮類化合物由于相似相溶而不斷溶出；當乙醇濃度過高時，粘度變大，極性過低，不利于黃酮類化合物溶出，同時溶出的醇溶性雜質增多，導致桂皮總黃酮提取率下降。因此，選擇乙醇濃度70%較為適宜。由圖1中C可知，隨著超聲功率的增加，桂皮總黃酮提取率先快速增加而后緩慢下降。隨著超聲功率增加，分子擴散加快，桂皮總黃酮提取率增加，但當超聲功率過大時，局部升溫過快，造成苷鍵水解和色素的溶出，導致桂皮總黃酮提取率下降。因此，選擇超聲功率500 W為宜。由圖1中D可知，隨著提取時間的延長，桂皮總黃酮提取率呈先增后減的趨勢；提取60 min時，總黃酮提取率達到最大，為5.01%。延長提取時間可以提高總黃酮提取率，但是時間過長導致桂皮總黃酮發生降解，提取率隨之下降。因此，選擇提取時間60 min較佳。

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 試驗設計與結果

根據2.1中試驗結果，以液料比20∶1、乙醇濃度70%、超聲功率500 W、提取時間60 min為中心點，桂皮總黃酮提取率為響應值，通過Design Expert 8.0軟件，運用Box-Benhnken中心組合試驗設計原理進行四因素三水平的響應面試驗設計，試驗方案設計與結果見表1。

表1 桂皮總黃酮提取的響應面試驗設計方案及結果Table 1 Response surface methodology design scheme and results for extraction of total flavonoids from cinnamon

續 表

2.2.2 方差分析與顯著性檢驗

對表1的數據進行二次回歸擬合，得桂皮總黃酮提取率(Y)與液料比(A)、乙醇濃度(B)、超聲功率(C)、提取時間(D)4個因素之間的二次回歸方程：

Y=-84.67458+2.00067A+0.98025B+0.075442C+0.54600D+5.00000E-005AB-4.85000E-004AC-6.00000E-004AD-2.57500E-004BC+1.82500E-003BD-2.35000E-004CD-0.041267A2-6.90417E-003B2-3.54167E-005C2-4.40417E-003D2。

方程的二次項系數為負值，表明方程代表的拋物面開口向下，具有極值點，可以進行優化分析。以桂皮總黃酮提取率為響應值，根據表1試驗結果，對桂皮總黃酮提取工藝模型進行回歸分析，結果見表2。

表2 桂皮總黃酮提取二次多項式模型的方差分析Table 2 Variance analysis of quadratic polynomial model of total flavonoids extracted from cinnamon

由表2可知，回歸模型顯著(P<0.0001)，失擬項不顯著(P=0.085)，說明該模型擬合充分，能夠用來描述桂皮總黃酮提取率與提取條件的關系。模型相關系數R2=0.9913，表明該模型可以解釋響應面中99.13%的可變性，可以用于桂皮在總黃酮提取最佳條件的確定。方程一次項中A，C，D，二次項中A2，B2，C2，D2，交互項中AC，BC，BD，CD對桂皮在總黃酮提取率影響最為顯著(P<0.0001)，其他項不顯著(P>0.05)，表明各因素之間影響是非線性關系。模型中根據F值大小可知，影響桂皮在總黃酮提取效果的因素按主次順序排列為：液料比(A)>超聲功率(C)>提取時間(D)>乙醇濃度(B)。

2.2.3 響應面分析

圖2 各因素交互效應對桂皮總黃酮提取率影響的響應圖Fig.2 Interactive effects of each factor on the extraction of flavonoids from cinnamon

響應曲面圖可以直觀地反映各因素相互作用對響應值的影響。其中曲線越陡峭，表明操作條件對響應值影響越顯著。

由圖2可知，乙醇濃度與超聲功率曲面最為陡峭，料液比與超聲功率、超聲功率與提取時間、乙醇濃度與提取時間均較為陡峭，可見這些因素的交互作用對桂皮總黃酮的提取率影響比較顯著，這與上述方差分析和顯著性檢驗正好相符。

2.3 驗證試驗

通過響應面試驗分析，確定桂皮總黃酮最佳提取條件為：液料比21.17∶1，乙醇濃度70.99%，超聲功率452.39 W，超聲處理時間63.19 min，在此條件下桂皮黃酮提取率的最大預測值為5.60%。考慮實際過程中的局限性，將工藝條件優化為液料比21∶1，乙醇濃度71%，超聲功率452 W，提取時間63 min。在此條件下進行3次驗證，得到桂皮總黃酮平均提取率為5.61%，與模型預測值接近，表明構建的模型對桂皮總黃酮提取工藝的模擬是可靠的。

3 結論

超聲提取法就是利用超聲波的空化效應、機械效應和熱效應，加速活性成分進入溶劑，同時粉碎植物細胞，使活性成分快速釋放至胞外，提取效率高[12]。黃酮類化合物在植物中廣泛分布，是植物經光合作用產生的一類天然產物，常以游離態或與糖苷形式存在[13]，具有廣泛的藥理活性，食用和藥用價值均比較高。桂皮作為古老而悠久的香辛料，含有豐富的黃酮類化合物。本文以桂皮總黃酮為研究對象，選用超聲輔助提取法，通過單因素試驗和響應面設計對其提取工藝進行優化，獲得最佳提取工藝條件為：液料比21∶1，乙醇濃度71%，超聲功率452 W，提取時間63 min，在此條件下桂皮總黃酮提取率為5.61%，與理論預測值(5.60%)基本一致。本研究為桂皮總黃酮的工業提取利用以及香辛料的科學開發提供了一定的科學依據。

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