沙棘黃酮檢測方法概述

陳 春

(1.山西省林業(yè)科學研究院，山西 太原 030012;2.國家林業(yè)局沙棘工程技術研究中心，山西 太原 030012)

沙棘為藥食兩用植物，一直以來都作為傳統(tǒng)藥物被用來治療疾病，收錄于《中國藥典》。沙棘含有多種化合物，包括黃酮類化合物、類胡蘿卜素、甾醇類、生育酚、脂類，還含有抗壞血酸、單寧等物質[1]，具有抗菌消炎、擴張冠狀動脈、治療高血壓和腦溢血、抗癌等作用。沙棘黃酮主要包括異鼠李素、槲皮素、山奈酚、楊梅素等黃酮苷元及其苷類物質[2]。現(xiàn)在，可從沙棘中分離出的黃酮類化合物達32種[3]，且含量較高。例如，中國沙棘果實每100 g含有黃酮885.4 mg；西藏沙棘果實的黃酮含量更高，每100 g含1 104.7 mg 黃酮。

沙棘黃酮含量作為評價沙棘品質的常見指標，其主要檢測方法包括：光譜分析法、色譜分析法、電化學分析法、化學發(fā)光法等。筆者對各檢測方法進行了綜述，旨在為今后沙棘黃酮的研究、開發(fā)及應用提供一定的參考。

1 光譜分析方法

1.1 紫外分光光度法

黃酮類化合物在紫外光圖譜上主要有2個吸收帶，環(huán)肉桂酰類物質在300 nm～550 nm產(chǎn)生的吸收帶以及環(huán)苯酰類物質在240 nm～280 nm產(chǎn)生的吸收帶[4]。通過對光譜區(qū)的吸光度值進行測定，根據(jù)溶液濃度和吸光度標準曲線進行計算可得到目標檢測物質的濃度值。利用紫外分光光度法檢測沙棘黃酮含量具有簡便、準確度高、重現(xiàn)性好且檢測技術易于掌握、儀器設備簡單的優(yōu)點[5]。紫外分光光度法檢測沙棘黃酮，具體又分為以下3種方法：亞硝酸鈉-氯化鋁-氫氧化鈉法、硝酸鋁-醋酸鉀法和三氯化鋁法。

1.1.1 亞硝酸鈉-氯化鋁-氫氧化鈉法

亞硝酸鈉-氯化鋁-氫氧化鈉法是沙棘黃酮檢測較為常見的方法之一，在氫氧化鈉提供的堿性環(huán)境條件下，金屬鋁離子與沙棘黃酮類物質反應生成紅色絡合物[6,7]。在對沙棘不同部位的黃酮進行檢測時，雖然對照品都是蘆丁，但最大吸收波長和使用的乙醇溶劑濃度不同。沙棘葉、果部位吸收波長為510 nm，而果渣為500 nm；沙棘葉使用乙醇溶劑的濃度為70%，沙棘果為35%乙醇，沙棘果渣為30%乙醇[8]。因此，在用亞硝酸鈉-氯化鋁-氫氧化鈉法檢測沙棘黃酮時，要嚴格控制溶劑的濃度、試劑的添加時間、顯色時間等，盡可能減少操作誤差。

1.1.2 硝酸鋁-醋酸鉀法

硝酸鋁-醋酸鉀法檢測沙棘黃酮含量，是依據(jù)鋁離子同黃酮類化合物中的3位羥基、4位羰基或5位羥基、4位羰基或鄰二酚羥基發(fā)生反應，生成絡合物，使得吸收峰紅移，從而測定出黃酮的含量[9]。

1.1.3 三氯化鋁法

三氯化鋁法的原理是在酸性條件下，沙棘黃酮醇母核中的5位羥基、4位羰基與金屬鋁離子絡合產(chǎn)生物對400 nm波長有最大吸收[10]。利用三氯化鋁法對沙棘黃酮進行測定時，應根據(jù)黃酮含量的不同選擇不同的對照標準品，包括蘆丁、槲皮素和異鼠李素，并且使用不同濃度的乙醇溶解[11]。

1.2 熒光分光光度法

熒光分光光度法(flourescence)的原理是：紫外線照射在由黃酮類物質與特定的金屬離子絡合產(chǎn)生的絡合物上時會產(chǎn)生熒光，在一定的條件下，熒光的強度與絡合物的濃度呈正相關，由此可以得到待測物質中黃酮類物質的總含量。雖然熒光光度法靈敏度高，準確性、重現(xiàn)性較好，同時具有操作簡便的優(yōu)點，在科研和生產(chǎn)實踐中應用于植物黃酮的檢測報道較多[12,13]，但是應用于沙棘黃酮檢測的報道較少[14]，有待進一步深入研究。

2 色譜分析方法

2.1 高效液相色譜法

黃酮類物質均具有不易揮發(fā)、熱不穩(wěn)定、分子離子峰穩(wěn)定，游離的苷元難溶或不溶于水、易溶于有機溶劑，黃酮苷易溶于水、甲醇、乙醇等強極性溶劑[15]的特點。因為黃酮苷具有極性強、難氣化、不穩(wěn)定的特點，所以高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)是重要的沙棘黃酮檢測方法。高效液相色譜法采用高壓液泵、高效固定相、液體流動相、高壓輸出進行檢測分析，具有分離效能高、分析速度快、靈敏度高的優(yōu)點，同時還可以得到沙棘待測樣品中各個黃酮組分的具體含量數(shù)值[16]。但也存在檢測設備昂貴、消耗流動相較多、檢測成本高的缺點。當前使用較多的是反相高效液相色譜[17，18]，分離柱為C8柱和C18柱，以甲醛-水、乙腈-水為流動相。流動相的選擇會直接影響出峰時間、分離度，可以通過調節(jié) pH 值來改善色譜圖的峰型。

2.2 薄層色譜法

薄層色譜法(TLCS)是將色譜技術和光密度計、電子計算機相結合的一種儀器分析方法。一定波長的光照射在薄層上，對薄層色譜中有紫外或可見光吸收的斑點，或經(jīng)照射能激發(fā)產(chǎn)生熒光的斑點進行掃描，將掃描到的圖譜及積分值換算為藥品的質量。薄層色譜法具有多通道效應，可以同時平行分離分析多個待測的沙棘樣品；流動相色譜使用量也較高效液相色譜少，且更換方便；對樣品的預處理要求也不高[19-21]。薄層色譜法是中藥制劑檢驗中較為常用的分析方法，在《中國藥典》中有33個中成藥品種采用該法進行含量測定。在沙棘黃酮檢測中也有使用，方法簡便、特異性強、重現(xiàn)性好,可作為沙棘黃酮檢測的優(yōu)選方法之一。

2.3 超臨界流體色譜法

超臨界流體色譜法(Super Fluid Chromatography，SFC)是20世紀80年代發(fā)展起來的一種新型色譜技術。它具有氣相和液相色譜所沒有的優(yōu)點,能分離、分析氣相和液相色譜不能解決的一些對象,應用廣泛,發(fā)展迅速。在使用超臨界流體色譜法檢測黃酮時，利用超臨界流體或添加了改性劑的超臨界流體做流動相，使黃酮單體分離后測定。目前該方法主要用于銀杏葉黃酮的檢測[22,23]，對沙棘總黃酮含量檢測應用的相對較少[24]。

3 毛細管電泳電化學法

毛細管電泳(Capillary electrophoresis, CE)又稱高效毛細管電泳(Highperfor-mance capillary electrophoresis, HPCE),是一種應用非常廣泛的分離分析技術，現(xiàn)已被廣泛應用于生物、醫(yī)藥等領域的樣品分離檢測[25]。毛細管電泳具有高靈敏度、高分辨率、高速度，分離檢測用時少、樣品和流動相用量少、成本低的優(yōu)點[26]。毛細管電泳電化學法是近年來發(fā)展迅速的分析檢測方法之一，也被應用在沙棘黃酮的檢測分析中[27]，但有待進一步發(fā)展。

4 流動注射化學發(fā)光法

流動注射分析(Flow Injection Analysis, FIA)是在非平衡熱力學條件下,在液流中重現(xiàn)地處理試樣或試劑區(qū)帶的定量流動分析技術。化學發(fā)光(Chemiluminescence, CL)是根據(jù)化學發(fā)光反應在某一時刻的發(fā)光強度或發(fā)光總量來確定反應中各組分的含量。將流動注射分析與化學發(fā)光結合形成的流動注射化學發(fā)光法(CL-FIA),是痕量分析法,具有分析速度快、線性范圍寬、精度和靈敏度較高、成本低和易于實現(xiàn)自動化等優(yōu)點[28],主要應用于藥物、食品、環(huán)境檢測以及元素分析等領域[29]。早在20世紀90年代初，已被應用于沙棘的檢測了[30]，但沒有得到推廣。

5 結論

對以上4類方法進行比較，可以看出，各種方法在實際使用過程中各有利弊。紫外分光光度法是廣泛使用的方法，其優(yōu)點是簡便、重復性好、易于學習掌握，使用的檢測儀器較為便宜，但也存在易受雜質干擾、穩(wěn)定性差的缺點。光譜分析法中的高效液相色譜法不僅具有抗干擾、重現(xiàn)性穩(wěn)定、分離效能高、分析速度快的優(yōu)點，而且可以精確的檢測沙棘總黃酮中各個具體成分的含量，是目前沙棘總黃酮檢測的主流趨勢。其它檢測方法在沙棘總黃酮檢測中應用較少，一方面是受使用儀器設備所限，不利于推廣普及；另一方面是應用于沙棘總黃酮檢測時，方法還不夠成熟穩(wěn)定，有待進一步探索研究。

隨著人們對沙棘黃酮作用的深刻認識，黃酮提取技術的不斷提高，以及儀器分析技術的日益進步，沙棘黃酮的檢驗檢測技術將來一定會更方便快捷、準確可靠。