腫瘤多藥耐藥模型建立方法的應用進展

湯婷婷，劉華鋼，梁燕，范玉琴，吳余燕

(1廣西中醫藥大學藥學院，南寧530299；2廣西醫科大學藥學院)

目前治療腫瘤的主要方法是化療。超過一半的腫瘤會對化療藥物產生多藥耐藥(MDR)，而腫瘤MDR的出現是致使化療失敗的原因之一。MDR是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物耐藥的同時，對非同類型的結構和作用機制不同的其他抗腫瘤藥物也產生交叉耐藥性。耐藥性的產生給腫瘤治療帶來巨大挑戰。腫瘤耐藥機制復雜，主要包括：p-糖蛋白(p-gp)、多藥耐藥相關蛋白(MRP)、乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)及肺耐藥蛋白(LRP)等高表達使得細胞內化療藥物外排，藥效作用減輕或消失；lncRNA通過調控與腫瘤耐藥信號通路相關基因、蛋白的表達來調控MDR的產生；MDR相關酶如谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)、蛋白酶C(PKC)、DNA拓撲異構酶Ⅱ(TopoⅡ)等活性增強或過度表達；抑制自噬可能導致腫瘤細胞MDR的產生；細胞凋亡機制異常；低氧誘導因子-1α(HIF-1α)表達上調[1～3]。目前關于腫瘤MDR機制的研究成為熱點。MDR體內和體外模型的建立為進一步闡明MDR的機制、逆轉腫瘤MDR和提高化療效果奠定了基礎[4，5]。隨著各種MDR模型建立方法的出現，建模方法的優劣勢也在實踐中充分體現。現對相關文獻報道的腫瘤MDR建模方法及其優劣勢綜述如下。

1 腫瘤MDR體外模型建立方法

主要分為高濃度反復間歇誘導法、藥物濃度遞增誘導法、高濃度反復間歇誘導與藥物濃度遞增相結合法、轉基因結合藥物篩選法和三維細胞培養法。上述5種建模方法各有優劣勢，需根據實驗需要進行選擇。

1.1 高濃度間歇誘導法 高濃度間歇誘導法是指選擇使用高劑量的藥物短時間作用后正常培養恢復，反復進行直到產生耐藥性[6]。李一春等[7]取對數生長期的人卵巢癌細胞OVCAR-3以IC50(10.0 μmol/L)的阿霉素(ADM)孵育2 h后，根據預實驗結果，舍棄含藥培養液改用普通1640繼續培養，保留存活細胞待長滿培養瓶后，再按相同的濃度給藥，反復重復上述換液、消化、傳代過程，每4周檢測耐藥性，4個月后最終獲得能完全耐受10.0 μmol/L ADM的細胞株OVCAR-3/ADM。張丹等[8]選取終濃度為500 ng/mL的培美曲塞二鈉(PEM)作為干預濃度作用于對數生長期的肺腺癌細胞A549，經過4個月反復沖擊，最終成功建立A549細胞培美曲塞耐藥株模型，獲得所需要耐藥指數為27.18±1.16的耐藥細胞株A549/PEM，誘導成功的A549/PEM較親本株A549形態不規則，兩種細胞株在倍增時間、生長曲線方面很相近，且脫藥4周后A549/PEM細胞仍能穩定生長、傳代。高濃度反復間歇法雖然誘導所需周期比較長，但制作過程更近似臨床周期性化療的用藥模式[9]。

1.2 藥物濃度遞增誘導法 該法為從低到高逐漸增加藥物濃度，直到誘導出MDR細胞系。洪廣亮等[10]取對數生長期的A549細胞，給予的耐百草枯(PQ)濃度從100 μmol/L開始，加藥24 h后換液去除藥物，待細胞重新生長至對數期后再次加相同濃度PQ刺激，如此重復3次后，延長暴露時間至48 h，重復上述過程，再依次增加PQ濃度(100、200、400、600、800 μmol/L)，連續培養11個月，成功建立A549耐PQ細胞株(A549/PQ)。張徐寧等[11]采用相似方法成功建立了耐DDP食管癌細胞系Eca109/DDP，細胞對DDP耐藥指數為15.886。藥物濃度遞增誘導法在實驗中運用率較高，建立的腫瘤MDR模型耐藥性相對穩定、可信。且所建耐藥株模型在撤藥或長時凍存后依然保持很高的耐藥性，大大提高了誘導成功率[12]，但此法建立耐藥株周期長，細胞的耐藥性與培養時間呈正相關。

1.3 高濃度反復間歇誘導與藥物濃度遞增相結合法 是將高濃度反復間歇誘導法與藥物濃度遞增法相結合的誘導方法。高愛麗[13]首先采用逐步加大ADM濃度(0.001、0.01、0.1、0.25、0.5、1.0 mg/L)培養乳腺癌細胞MCF-7 3個月，篩選出存活細胞，之后在無藥普通培養液中培養4周；同時采用高濃度反復間歇誘導法誘導，即給予1 mg/L的ADM培養4代，篩選存活細胞，之后在無藥普通培養液中培養4周；將以上兩種方法獲得的存活細胞株放在一起共同培養，加入1 mg/L的ADM；最后在無藥普通培養液中培養4周，整個過程持續約5個月，成功建立了耐ADM乳腺癌細胞系MCF-7/ADM。趙寶霞[14]采用逐步遞增吉非替尼濃度、間歇作用體外誘導法誘導EGFR基因19外顯子缺失突變的人肺癌細胞株NCI-H1650產生耐藥，成功建立了耐藥模型EGFR-TKI。高濃度反復間歇誘導與藥物濃度遞增相結合法穩定性好，耐藥倍數高于兩種方法單獨運用所建的模型，但該法實驗步驟繁瑣，藥物劑量不好把握，且培養周期長。

1.4 轉基因結合藥物篩選法 該法優勢是建立的耐藥模型所需時間短、耐藥基因型單純、耐受性強、效率高、穩定等，是近年來新興的耐藥細胞建模方法。榮小麗[15]利用LIMK1基因轉染人骨肉瘤耐藥細胞系MG6/VCR，通過長春新堿短暫誘導和G418篩選，建立LIMK1基因穩定轉染的MG6/VCR。

1.5 三維細胞培養法 三維細胞培養法是指利用具有三維結構的材料作為載體與腫瘤細胞在體外一起培養，讓腫瘤細胞能夠在載體的三維體系中呈三維狀態生長、遷移，成為三維細胞-載體復合物。三維培養的腫瘤細胞耐藥性與在體腫瘤相近且與單層細胞相比耐藥性明顯增強。姜昊聲等[16]取對數期生長期的MCF-7細胞消化成單細胞懸液，用完全培養基潤洗加凝膠微孔支架的3D多細胞球培養板，加入細胞懸液培養3 d后加ADM培養液，于加藥培養3 d后計算細胞耐藥指數，結果顯示三維培養的MCF-7細胞對ADM明顯耐藥，說明成功建立了乳腺癌MDR模型。徐紅等[17]首先制備MCF-7細胞懸液備用，隨后將Ⅰ型鼠尾膠原溶液與PBS、NaOH混合，使Ⅰ型鼠尾膠原的終濃度為2.0 g/L；將備用的MCF-7細胞調節至適宜密度接種至膠原溶液并混合均勻，將其混合液加入孔板置于37 ℃、5% CO2培養箱培養，隨后加藥、觀察、檢測，結果顯示三維培養的腫瘤細胞出現對5-氟尿嘧啶、ADM、卡鉑的藥物敏感性顯著降低的現象，細胞中P-gp、mrp2 mRNA及P-gp蛋白表達增高，成功構建了具有耐藥表型的乳腺癌三維培養模型。三維細胞培養法建立的MDR模型生物學活性與在體腫瘤更接近且能模擬其微環境，能更真實地模擬藥物與腫瘤的互相作用，但培養系統較復雜，且實驗周期長[18]。

2 腫瘤MDR體內模型建立方法

國內外對MDR機制的認識和逆轉劑的研發除了來自體外細胞實驗的研究成果，還得益于體內模型即動物模型的建立。體外細胞實驗研究的是體外誘導的細胞，而動物模型能更好地反映體內腫瘤形成的情況。MDR動物模型的建立是研究逆轉腫瘤細胞MDR體內實驗的必要基礎。目前，MDR體內模型分為移植型和誘導型兩種，最常用的實驗動物為小鼠和大鼠，近些年斑馬魚因其個體小、胚胎透明、實驗周期短，基因與人類極其相似也廣泛用于人類疾病模型的建立[19]。胡榮英等[20]利用長春新堿暴露處理受精后的斑馬魚，結果顯示長春新堿能增加班馬魚腫瘤耐藥基因abcb4的表達，該模型建立提示復制腫瘤MDR模型可利用斑馬魚進行實驗。

2.1 移植型腫瘤MDR動物模型 為直接將耐藥細胞株或腫瘤組織接種到動物體內的方法。井歡等[21]在體外培養肺腺癌耐藥細胞A549/DDP，取對數生長期細胞消化制備成懸浮液，將其注射于健康BALB/c小鼠腋下，5 h后觀察到腋下有米粒突起，建模成功，建立的移植瘤細胞對DDP的耐藥倍數與原代細胞相比差別不大，此法建模周期短且成瘤率高。張琦等[22]將人腎癌腫瘤組織塊穿刺接種到小鼠腎實質組織中，建立腎癌原位腫瘤模型，術后2周B超檢查見腫瘤發生，HE染色顯示腎癌原位模型腫瘤呈浸潤性生長，膀胱癌模型可見明顯突向膀胱腔的癌組織團塊。細胞株移植建立的MDR動物模型具有創傷面積小、易于重復、操作簡單易行、腫瘤位于淺表方便觀察、耐藥性較穩定、個體差異較小、實驗周期較短等優點；不足是用于移植的耐藥株耐藥指數越高，在動物體內的致瘤率越低。腫瘤組織塊移植方法建立的MDR模型彌補了細胞接種法容易漏失到腹腔的缺點，也不會因細胞接種法帶來的后續問題對種植腫瘤造成影響，但所耗周期比較長[23]。

2.2 誘導型腫瘤MDR動物模型 這種方法是仿照人體MDR的形成過程來建立MDR動物模型。曹淵等[24]首先對健康裸鼠采用直線加速器3 Gy全身照射及背部皮下注射對數生長期的白血病細胞K562，成功建立K562細胞株裸鼠荷瘤模型；然后在已經成瘤的裸鼠瘤內持續8周注射低劑量ADM，成功建立耐ADM的裸鼠荷瘤模型。盛秀勝等[25]使用小劑量多柔比星誘導S180荷瘤小鼠，此方法是將含有小鼠腹水型肉瘤細胞株S180移植到小鼠體內，待成功建立小鼠肉瘤模型后，利用小劑量多柔比星誘導法注射誘導劑，反復給藥，持續8周，成功建立了耐多柔比星的S180荷瘤小鼠模型。該法克服了一些化療方案所誘導的S180荷瘤小鼠死亡率高的缺點，彌補了由于化療藥物作用影響因素過于復雜而無法獲取相對一致的模型的劣勢。但該法所建立的模型耐藥倍數不高，所以并不適合建立要求耐藥倍數高的動物模型。

綜上所述，高濃度反復間歇誘導法、藥物濃度遞增誘導法、高濃度反復間歇誘導與藥物濃度遞增相結合法、轉基因結合藥物篩選法和三維細胞培養法這五種腫瘤MDR體外模型建立方法各有優劣勢，其中三維細胞培養法建立的MDR模型生物學活性與在體腫瘤更接近且能模擬體內微環境，彌補了其他四種方法的不足，但培養系統較復雜、實驗周期長。移植型MDR動物模型和誘導型MDR動物模型作為腫瘤MDR體內模型建立方法優勢明顯，均能保持動物原有的組織學構造及原腫瘤細胞的各項特性，重現原始腫瘤結構，能模擬體內微環境，反映體內腫瘤形成情況，使得實驗結果更具有可靠性和說服力。我們還可以在體內模型建模時間、成瘤率及建模動物類型方面有所突破，以優化腫瘤MDR體內模型的構建，為深入研究耐藥機制和耐藥逆轉方法奠定基礎，為開發新的抗腫瘤藥物提供參考。

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