卵子透明帶激光淺層、深層打孔卵胞質內單精子顯微注射體外受精效果對比觀察

于成和，張麗蓉，柴蓓蓓，張若鵬,李娟

(大理大學第一附屬醫院，云南大理 671000)

卵子存活率，改善不孕癥治療結局[2]。然而國內外并未報道透明帶削薄程度對ICSI結局的影響。本研究比較了透明帶不打孔、淺層打孔、深層打孔ICSI操作的注射深度、胞質漏出率、卵子存活率、受精率、2PN率、優質胚胎率，探討透明帶激光打孔輔助ICSI操作時最適宜的打孔深度。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年5月～2017年3月于大理大學第一附屬醫院生殖醫學科接受長效長方案+ICSI治療的男性不育癥夫婦為研究對象。夫妻雙方均同意選擇“激光輔助ICSI術”治療并簽署知情同意書。妻子年齡為(28.7±3.7)歲，丈夫年齡(29.1±3.8)，不育年限(4.3±3.1)年，Gn天數(10.6±1.7)d，Gn用量(1 973.52±635.32)IU，獲得成熟卵子數(11.6±4.8)枚，卵子直徑(159.16±11.22)μm，透明帶厚度為(16.32±3.02)μm。若獲得成熟卵子數≤2枚，則均行常規ICSI；若獲得3枚成熟卵子，第1、2枚卵子行常規ICSI，第3枚行透明帶淺層激光打孔+ICSI；若獲得4枚成熟卵子，第1、2枚卵子行常規ICSI，第3枚行透明帶淺層激光打孔+ICSI，第4枚行透明帶深層激光打孔+ICSI；若獲得5枚成熟卵子，第1、2、5枚卵子行常規ICSI，第3枚行透明帶淺層激光打孔+ICSI，第4枚行透明帶深層激光打孔+ICSI；若獲得6枚成熟卵子，第1、2、5、6枚卵子行常規ICSI，第3枚行透明帶淺層激光打孔+ICSI，第4枚行透明帶深層激光打孔+ICSI；若獲得7枚成熟卵子，第1、2、5、6枚卵子行常規ICSI，第3、7枚行透明帶淺層激光打孔+ICSI，第4枚行透明帶深層激光打孔+ICSI；若獲得8枚成熟卵子，第1、2、5、6枚卵子行常規ICSI，第3、7枚行透明帶淺層激光打孔+ICSI，第4、8枚行透明帶深層激光打孔+ICSI；以此類推。共有483枚成熟卵子接受常規ICSI，為C-ICSI組；237枚成熟卵子接受透明帶淺層激光打孔+ICSI，為LA1-ICSI組；182枚成熟卵子接受透明帶深層激光打孔+ICSI，為LA2-ICSI組。

1.2 控制性超促排卵、透明帶激光打孔及ICSI操作方法 根據文獻[3]方法對患者實施長方案促排卵，當超聲檢查可利用卵泡(≥16 mm)數達卵泡總數60%以上時，給予250 mg重組人絨毛膜促性腺素(hCG)誘導卵泡成熟。注射hCG后36～38 h，經陰道超聲指引下取卵。根據實驗室ICSI操作常規[4]完成安裝并調整注射針(ICSI針)及持卵針(Holding針)、配注射盤、卵子隨機裝入注射滴內等準備工作，并將精子制動后吸入注射針內待注射。Holding針在3點鐘位置固定卵子，撥動卵子，使極體處于6或12點鐘。C-ICSI組按照常規方法[4]行ICSI，LA1-ICSI組、LA2-ICSI組在9點鐘位置使用激光破膜儀(RI公司，英國)分別在透明帶淺層(削薄厚度<1/2透明帶)、深層(削薄厚度≥1/2透明帶)低能量單次打孔(激光脈沖寬度<0.4 ms，孔徑尺度約3 μm)，每次激光打孔的孔徑和強度一致。打孔結束后，注射針穿過孔徑完成注射過程。

1.3 體外受精效果相關指標檢測方法 ①ICSI過程中觀察穿刺深度和胞質漏出情況。穿刺深度是指進針結束抽吸卵胞質時，針尖至透明帶外側緣穿刺點的距離。胞質漏出是指回吹胞質時觀察到胞質從針嘴漏出，或注射結束卵間隙內可見漏出胞質，計算胞質漏出率。胞質漏出率=胞質漏出卵子個數/成熟卵子總數×100%。②ICSI后16～18 h觀察卵子存活及受精情況，胞質內觀察到2個原核(PN)視為正常受精。計算卵子存活率、受精率、2PN率。卵子存活率=存活卵子數/成熟卵子總數×100%，受精率=(2PN+1PN+多PN)卵子數/成熟卵子總數×100%，2PN率=2PN數/成熟卵子總數×100%。③ICSI后43～45 h采用四級評分法評估胚胎質量[5]，Ⅰ、Ⅱ級胚胎評定為優質胚胎。優質胚胎率=(Ⅰ級胚胎數+Ⅱ級胚胎數)/2PN胚胎數×100%。

2 結果

2.1 三組注射深度和胞質漏出情況比較 C-ICSI 組、LA1-ICSI組、LA2-ICSI組注射深度分別為(64.72±8.97)、(50.63±5.77)、(45.44±6.75)μm。LA1-ICSI組、LA2-ICSI組注射深度少于C-ICSI組(P均<0.05)；LA1-ICSI組注射深度與LA2-ICSI組相比，P>0.05。C-ICSI組、LA1-ICSI組、LA2-ICSI組胞質漏出率分別為25.05%(121/483)、28.69%(68/237)、35.71%(65/182)。LA2-ICSI組胞質漏出率高于C-ICSI組，P<0.05；LA1-ICSI組胞質漏出率與LA2-ICSI組和C-ICSI組相比，P均>0.05。

2.2 三組卵子存活及受精情況比較 C-ICSI 組、LA1-ICSI組、LA2-ICSI組卵子存活率分別為85.71%(414/483)、95.78%(227/237)、98.90%(180/182)。LA1-ICSI組、LA2-ICSI組卵子存活率高于C-ICSI組(P均<0.05);LA1-ICSI組卵子存活率與LA2-ICSI組相比，P>0.05。C-ICSI 組、LA1-ICSI組、LA2-ICSI組受精率分別為78.26%(378/483)、81.86%(194/237)、75.27%(137/182)，三組受精率相比，P均>0.05。C-ICSI組、LA1-ICSI組、LA2-ICSI組2PN率分別為70.60%(341/483)、72.15%(171/237)、68.68%(125/182)，三組2PN率相比，P均>0.05。

2.3 三組優質胚胎率比較 C-ICSI組、LA1-ICSI組、LA2-ICSI組優質胚胎率分別為47.80%(163/341)、58.48%(100/171)、39.20%(49/125)。LA1-ICSI組優質胚胎率顯著高于C-ICSI組和LA2-ICSI組(P均<0.05)；LA2-ICSI組優質胚胎率與C-ICSI組相比，P>0.05。

3 討論

在臨床工作中，ICSI治療結局可受多方面因素影響，例如實驗室技術人員操作方法、卵子質量、精子質量等[6]。與IVF相比，ICSI具有更高受精率，但并沒有得到更高囊胚形成率及著床率，其原因可能與注射過程損傷卵子和精子有關。因此，探討適宜的方法進一步減少注射對卵子的影響是ICSI相關臨床研究的熱點[7]。有學者用激光在透明帶上打孔，再通過該孔完成ICSI，發現該方法能有效提高卵子成活率[8]。本研究結果顯示，LA1-ICSI組和LA2-ICSI組注射深度均顯著低于C-ICSI組，而LA1-ICSI組注射深度比LA2-ICSI組深；LA1-ICSI組和LA2-ICSI組卵子存活率均顯著高于C-ICSI組，而LA2-ICSI組卵子存活率略高于LA1-ICSI組。表明透明帶淺層、深層激光打孔后行ICSI可以通過降低注射阻力而降低注射深度，從而減少注射對卵子所產生的機械損害，因此顯著提高了卵子存活率。對于獲卵數較少的患者，這種新方法能額外挽救卵子，具有較高臨床價值。

文獻報道，透明帶激光打孔輔助ICSI可提高優質胚胎率[3]，并提高胚胎著床率[9]。本研究結果顯示，LA1-ICSI組優質胚胎率顯著高于C-ICSI組，與文獻[9]報道類似。本研究結果還顯示，LA1-ICSI組優質胚胎率高于LA2-ICSI組，LA2-ICSI組優質胚胎率僅與C-ICSI組相當，表明采用透明帶深層激光打孔不但不能進一步提高胚胎質量，還會降低胚胎質量。究其原因，一是透明帶除了支持保護卵子外，還為卵母細胞提供必要的物質通道。有研究表明，在透明帶表面鑲嵌著許多蛋白，任何一種蛋白的缺失都會影響透明帶功能和卵子、胚胎的發育[10]。因此，透明帶上激光打孔越深，對透明帶結構破壞越大，越影響其生理功能，反而影響胚胎發育。其二，透明帶深層激光打孔能破壞卵間隙相對密閉的環境，減少卵間隙抽吸負壓，降低注射過程中細胞膜回收能力，導致胞質易漏出。其三，透明帶上激光打孔較深導致注射深度較淺，細胞膜不能完全封閉ICSI針口，導致胞質漏出，從而降低胚胎發育能力。本研究結果顯示，LA2-ICSI組胞質漏出率高于C-ICSI組、LA1-ICSI組，可以解釋本研究結果。

文獻報道，透明帶激光打孔可提高ICSI受精率，對臨床妊娠率無明顯影響[9]。而有研究[3]表明透明帶激光打孔并不能顯著提高ICSI后受精率。本研究結果顯示，LA1-ICSI組受精率最高，C-ICSI組次之，LA2-ICSI組最低，雖然組間差異均無統計學意義，但也說明透明帶激光打孔對ICSI卵子受精是有利的[11～14]。

綜上所述，與不打孔相比，透明帶淺層、深層激光打孔后行ICSI注射深度較低，卵子存活率和優質胚胎率較高。與透明帶淺層激光打孔相比，透明帶深層激光打孔后行ICSI可以進一步降低注射深度，但優質胚胎率降低。ICSI前應該行透明帶淺層激光打孔。

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