miR-let7c對小鼠精原細胞株GC-1spg細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A表達的調控作用

王歡，江莉，唐媛媛，周潔

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

男性不育癥病因復雜，目前認為主要的病因有染色體結構或基因調控異常、全身性或神經性疾病、感染、外傷、醫源性損傷、內分泌失調、環境因素、免疫因素等。精子發生是一個復雜的多因素調控過程，miRNA通過調控其靶基因轉錄和翻譯而影響精子發生過程。研究表明，miRNA let7家族在精子運動、獲能、受精和胚胎發育中有重要作用，但具體機制不清楚[1]。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A(CDKN1A)是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CDKI)家族成員之一，是細胞周期重要的調控因子。本研究通過轉染miR-let7c沉默及過表達慢病毒質粒載體，初步研究miR-let7c對精原細胞系GC-1spg中CDKN1A表達的影響，探討miR-let7c對精子發生影響的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠精原細胞株GC-1spg購自中國科學院典型培養物保藏委員會昆明細胞庫；miR-let7c過表達、沉默表達慢病毒和空載對照慢病毒包裝等由上海吉凱基因科技有限公司完成；AxyPrep總RNA小量制備試劑盒購自Axygen公司；引物內參GAPDH、Reverse Transcriptase、SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，引物設計、合成也由日本TaKaRa公司完成；10%胎牛血清、Trypsin-EDTA Solution和DMEM培養基購自Gibco公司；內參β-actin(HRP標記)購自PTG公司；羊抗兔二抗購自ABCAM公司。

1.2 miR-let7c慢病毒載體的構建 設計合成帶有末端保護堿基、AgeI、EcoRI的酶切位點的mmu-miR-let7c引物。mmu-miR-let7c上游引物序列為5′-GGAAAGGACGAAACACCGGTATTCTATCTACAACC-TTGCCAAGC-3′，下游引物序列為5′-TGTCTCGAGGTCGAGAATTAAAAAAGGTAATGCATTAAGGCCTC-3′；mmu-let-7c-5p-inhibition上游引物序列為5′-AATTCAAAAATGAGGTAGTAGGTTGTATGGTT-3′，下游引物序列為5′-CCGGAACCATACAACCTACTACCTCATTTTTG-3′。擴增pre-miR-let7c序列。經酶切后連接入慢病毒表達載體GV309(miRNA慢病毒載體)或GV280(miRNA-inhibition慢病毒載體)，慢病毒載體元件順序：hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin。經轉化、PCR法篩選挑取陽性克隆，經測序鑒定為pre-miR-let7c序列后抽提質粒。GV309-miR-let7c(對照組為GV309空質粒)、Helper1.0、Helper 2.0三質粒共轉染293T細胞，以10%FBS的DMEM培養48～72 h后收集上清即為病毒。

1.3 細胞分組及miR-let7c過表達、沉默表達慢病毒質粒轉染 GC-1spg細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中培養，放置在37 ℃、5%CO2的培養箱。將處于對數生長期的GC-1spg細胞消化成細胞懸液分入6孔板中培養，當融合度為10%～20%時進行轉染。設miR-let7c上調組、miR-let7c下調組和對照組，分別轉染miR-let7c過表達慢病毒、miR-let7c沉默表達慢病毒、空載病毒，感染復數(MOI)=75，感染72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達并計算轉染效率，轉染效率>90%者繼續培養用于后續實驗。

1.4 各組精原細胞CDKN1A mRNA檢測 提取各組精原細胞總RNA，測定RNA濃度及純度。按照TaKaRa公司逆轉錄試劑盒說明書反轉錄成單鏈cDNA。以GAPDH為內參照行實時熒光定量PCR反應。CDKN1A上游引物序列為5′-GTCGCTGTCTTGCACTCTGG-3′，下游引物序列為5′-CCAATCTGCGCTTGGAGTGATA-3′；GAPDH上游引物序列為5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，下游引物序列為5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。實時定量PCR反應體系均為20 μL，其中包括Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物終濃度0.8 μmol/L，其余體積用滅菌水補足。在Lightcycler 96 PCR儀中使用兩步法擴增：預變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火與延伸60 ℃ 20 s，共40個循環。每次循環結束時收集熒光。以2-ΔΔCt表示三組CDKN1A mRNA相對表達量，實驗重復3次，取平均值。

1.5 三組CDKN1A蛋白檢測 采用Western blotting法。先用RIPA裂解液提取各組細胞的總蛋白，BCA蛋白定量法測定蛋白光密度(OD)值，根據蛋白含量繪制標準曲線，配置5%濃縮膠和12%分離膠，在電泳槽內加入電泳緩沖液，80 V恒壓電泳至溴酚藍跑出濃縮膠層，時間約為30 min，分離膠電泳為120 V。當溴酚藍遷移至距離分離膠下緣約1 cm時終止電泳，轉膜。400 mA穩流電轉移1 h，將PVDF膜浸入5% BSA的封閉液中，室溫封閉1 h。使用ECL化學發光顯影。以CDKN1A條帶和內參照β-actin條帶灰度值之比表示CDKN1A蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 三組CDKN1A mRNA表達比較 miR-let7c上調組、miR-let7c下調組、對照組CDKN1A mRNA相對表達量分別為0.005 6±0.000 9、0.039 1±0.006 7、0.021 9±0.001 8。與對照組比較，miR-let7c上調組CDKN1A mRNA相對表達量低于miR-let7c下調組及對照組(P均<0.01)，miR-let7c下調組CDKN1A mRNA相對表達量高于對照組(P<0.01)。

2.2 三組CDKN1A蛋白表達比較 miR-let7c上調組、miR-let7c下調組、對照組CDKN1A蛋白相對表達量分別為0.034 8±0.002 6、0.833 5±0.053 2、0.257 4±0.070 9。與對照組比較，miR-let7c上調組CDKN1A蛋白相對表達量低于miR-let7c下調組及對照組(P均<0.01)，miR-let7c下調組CDKN1A蛋白相對表達量高于對照組(P<0.01)。

3 討論

miRNA是內源性的非編碼小分子RNA，長度為22～24個核苷酸。miRNA通過與靶mRNA 3′-UTR區形成互補序列，使靶mRNA降解或者抑制其翻譯，從而調控基因的轉錄后水平[2]。miRNA主要是對內源性mRNA進行修飾，并且在表達上具有發育時序性和組織特異性，參與細胞的生長、增殖和凋亡等過程。miRNA在哺乳動物的睪丸、附睪、精子和精漿中廣泛表達，并在原始生殖細胞(PGCs)、精原干細胞(SSCs)和精原細胞中有更高的表達水平，參與精子發生發育和成熟的各個階段[3]，因而被認為是生殖細胞發育的強有力調節器。目前已發現miR-17-92簇和miR-let-7家族(a、d、e、c、g)能調控PGCs增殖和發育。miR-17-92基因簇是含有共同miRNAs位點的4個不同miRNA家族(miR-17、miR-18、miR-19、miR-25)，可能參與SSCs的早期分化，也在未分化的精原細胞中表達，在分化過程中表達下調。miR-17-92基因簇能下調E2F1基因，避免精子發生過程中減數分裂的細胞凋亡。敲除miR-17-92基因簇的成年小鼠，其生殖功能障礙，出現異常的睪丸表型，包括睪丸嚴重萎縮、精原細胞和SSCs丟失、生殖細胞凋亡和精子生成減少等[4]。let7被廣泛用于腫瘤和干細胞包括多種細胞抗凋亡和增殖途徑的相關研究[5]。有研究發現，let-7能直接調節細胞周期關鍵的原癌基因，如RAS、CDC25A、CDK6、Cyclin D等，阻斷細胞G1/S期的轉換過程，從而抑制腫瘤細胞增殖[6]。精子發生是精原干細胞不斷自我更新、動態的、復雜的過程，SSCs的自我更新和細胞池之間的平衡受到嚴格而周密的調控，當SSCs出現過度的自我更新或分化時，打破了平衡的調控網，從而導致男性不育[7]。Toledano等[8]研究發現let-7過表達可導致果蠅生殖干細胞減少。Shinoda等[9]認為過表達的let-7通過靶向Lin28a減少雄性生殖細胞的數量。此外，精漿中miR-19b和let-7a的異常表達可導致生精障礙[10]。在睪丸組織中，miR-let-7a-1、miR-let-7a-2、miR-1et-7a-3、miR-let-7b、miR-1et-7c、miR-let-7d、miR-let-7d-v1、miR-let-7d-v2、miR-let-7e、miR-let-7f-1、miR-let-7g等特異表達，在維持干細胞增殖、分化和自我更新能力的過程中也起到重要調控作用。因此我們選擇miR-let7c為研究目標，探討其在精子發生中的作用機制。

本研究結果顯示miR-let7c上調組GC-1spg細胞中CDKN1A mRNA和蛋白表達量顯著降低，miR-let7c下調組GC-1spg細胞中CDKN1A mRNA和蛋白表達量顯著升高，說明miR-let7c能夠負向調控CDKN1A的表達。miRNA的調控作用貫穿到精子發生發育和成熟的整個過程。這些過程需要一個精準的、具有空間性和時間性的基因調控表達模式。目前已經發現了一些與精子活力有關的基因，如Tektin-2、DNAI1、DNAH5、DNAH11、AKAP3、AKAP4、SEPT4、SMCP、SEMG1、CRISP2等。CDKN1A是細胞周期重要的負性調控因子，可與G1-S/CDK(G1-S/細胞周期蛋白依賴激酶，CDK2)和S/CDK復合物結合，調節細胞周期G1期向S期過渡過程[11]，在轉錄、翻譯后修飾、DNA復制和修復等途徑中發揮重要作用。此外CDKN1A還扮演調節細胞存活和細胞凋亡的雙重角色，這主要取決于CDKN1A在細胞內的定位[12]。CDKN1A對調節精原干細胞種系傳遞起關鍵作用，被認為是維持睪丸生殖細胞完整性的守護者[13]。在正常睪丸組織，CDKN1A在粗線期精母細胞和精子細胞中的表達最高[5]。精母細胞、精子細胞和精子等雄性生殖細胞對DNA損傷因素易感，而DNA損傷途徑受到CDKN1A的調控，后者還參與DNA損傷后的細胞周期進程[14,15]。當CDKN1A的表達受到抑制，在細胞沒有進行DNA修復的時候就進入細胞周期，復制了錯誤的遺傳信號，阻滯了細胞周期進程。結合本研究結果，筆者推測，在SSCs的自我更新或分化中，為了避免出現過度活躍的細胞增殖，miR-let7c通過負向調控CDKN1A而抑制細胞增殖，阻滯了細胞周期G1期向S期過渡，維持SSCs細胞池之間的平衡，確保精子發生調控過程的精準性。

目前對miRNA參與生殖細胞增殖、分化和凋亡的調控作用的研究主要集中在精子發生的中晚期階段，而對精子發生早期階段的研究較少，尤其是從精母細胞到精原細胞的過程。本研究結果為后續探討miR-let7c在男性不育臨床診斷及治療中的應用提供了理論依據。而miR-let7c如何通過CDKN1A調控精子發生的作用機制將有待進一步研究。

參考文獻：

[1] Tong MH, Mitchell D, Evanoff R, et al. Expression of Mirlet7 family microRNAs in response to retinoic acid-induced spermatogonial differentiation in mice[J]. Biol Reprod, 2011,85(1):189-197.

[2] Wang B, Ricardo S. Role of microRNA machinery in kidney fibrosis[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2014,41(8):543-550.

[3] Luo Z, Liu Y, Chen L, et al. MicroRNA profiling in three main stages during porcine spermatogenesis[J]. Assist Reprod Genet, 2015,32(3):451-460.

[4] Xie R, Lin X, Du T, et al. Targeted disruption of miR-17-92 impairs mouse spermatogenesis by activating mTOR signaling pathway[J]. Medicine (Baltimore), 2016,95(7):e2713.

[5] Kim JM, Lee ST, Chu K.Inhibition of Let7c MicroRNA is neuroprotective in a rat intracerebral hemorrhage model[J]. PLoS One, 2014,24;9(6):e97946.

[6]Johnson CD, Esquela Kerscher A, Stefani G. The let-7 microRNA represses cell proliferation pathways in human cells[J]. Cancer Res, 2007,1567(16):7713-7722.

[7] Kanatsu Shinohara M, Takashima S. Transmission distortion by loss of p21 or p27 cyclin-dependent kinase inhibitors following competitive spermatogonial transplantation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010,107(14):6210-6215.

[8] Toledano H, D′Alterio C, Czech B, et al. The let-7-Imp axis regulates ageing of the Drosophila testis stem-cell niche[J]. Nature, 2012,485:605-610.

[9] Shinoda G, De Soysa TY, Seligson MT, et al. Lin28a regulates germ cell pool size and fertility[J]. Stem Cells, 2013,31:1001-1009.

[10] Wu W, Hu Z, Qin Y, et al. Seminal plasma microRNAs: potential biomarkers for spermatogenesis status[J]. Molecul Human Reprod, 2012,18(10):489-497.

[11] Erkekoglu P, Rachidi W, Yuzugullu OG, et al. Induction of ROS, p53, p21 in DEHP- and MEHP-exposed LNCaP cells-protection by selenium compounds[J]. Food Chem Toxicol, 2011,49:1565-1571.

[12] Cmielova J, Rezacova M. p21Cip1/Waf1 protein and its function based on a subcellular localization[J]. Cell Biochem, 2011,112(12):3502-3506.

[13] Russell LD, Chiarini-Garcia H, Korsmeyer SJ, et al. Bax-dependent spermatogonia apoptosis is required for testicular development and spermatogenesis[J]. Biol Reprod, 2002,66(4):950-958.

[14] Abbas T, Dutta A. p21 in cancer: intricate networks and multiple activities[J]. Nat Rev Cancer, 2009,9(6):400-414.

[15] Solek P, Majchrowicz L, Bloniarz D, et al. Pulsed or continuous electromagnetic field induce p53/p21-mediated apoptotic signaling pathway in mouse spermatogenic cells in vitro and thus may affect male fertility[J]. Toxicology, 2017,382:84-92.