ERIC-PCR技術在動物流行病學調查中的應用

朱佳文 ，吳永勝 ，許禎瑩 ，蘇志鵬 ，邱時秀 ，李娟 *

（1.成都市農林科學院畜牧研究所，四川 溫江 611130；2.四川特驅投資集團有限公司，四川 雙流 610207）

近幾年，越來越多的科研工作者開始專注于腸道微生物的研究，ERIC-PCR技術以其操作簡單、試驗重復性高和分辨力強等優點而被廣泛利用。

1 ERIC-PCR技術的背景

ERIC是腸桿菌間保守的重復基因序列，能夠同時比較大規模微生物樣品的序列結構特征。ERIC序列長為126bp，存在于基因組的轉錄區域，其序列具有高度保守性，但在不同物種染色體上的定位不同。Hulton等[1]指出ERIC序列存在于許多腸道菌中，而且可以作為大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和其他一些腸道微生物新的重復單元家族。同年，Versalovic等[2]發現可以通過ERIC序列設計引物對細菌進行PCR擴增，得到不同細菌基因組的指紋圖譜。由于ERICPCR技術能夠得到敏感性好和重復性高的ERICPCR指紋圖譜，因而該技術逐漸被利用在各種不同的環境微生物生態學研究中，并且取得了較好的結果。

2 ERIC-PCR檢測原理及優缺點

ERIC-PCR原理是根據ERIC核心序列（44bp）設計引物進行PCR擴增，Versalovic等[2]早在1991年便設計了一對反向引物（ERIC1：5′-ATGTAAGCTCCT GGGGATTCAC-3′，ERIC2：5′-AAGTAAGTGACTGGG GTGAGCG-3′），用于擴增兩個相鄰的ERIC保守序列之間的區域，由于不同細菌基因組上ERIC重復序列的數目和分布不同，得到的DNA指紋圖譜也不同，擴增產物的大小在50～3000bp之間，根據電泳帶上不同的DNA片段可以分析菌種類型。

相對于其他分子流行病學分型方法，ERIC-PCR具有操作簡單、靈敏度高、重復性好的優點。ERICPCR技術能夠有效區分細菌菌株間的差異性，在流行病學調查中具有重要價值。雖然ERIC-PCR技術是一種有效的細菌基因分型方法，但仍存在不足。若想得到更好的圖譜豐度和準確性則需要不斷地優化條件或結合其他方法共同檢測。潘康成等[3]于2010年分別利用ERIC-PCR和PCR-DGGE技術對肉雞喂服枯草芽孢桿菌后的腸道菌群多樣性進行研究，雖然兩種方法的結果均顯示飼喂枯草芽孢桿菌后能提高肉雞腸道微生物的豐度和種群密度，但從指紋圖譜和統計條帶數量上看，PCR-DGGE技術更優于ERIC-PCR技術。

3 ERIC-PCR在動物流行病學調查中的應用

3.1 ERIC-PCR在監測動物腸道微生物多樣性上的應用 動物腸道微生物在機體發育、免疫、營養物質代謝和疾病發生等方面都有非常重要的作用，而ERIC-PCR作為一種快速有效的分析腸道微生物菌群結構和動態平衡的分子生物學手段已有越來越廣泛的應用。2005年，魯海峰等[4]抽提大熊貓糞便樣品中的微生物總DNA，并以此為模板進行ERIC-PCR擴增和Southern雜交，比較了各DNA樣品指紋圖譜的相似性指數。結果發現大熊貓不同個體間的腸道微生物群落結構比較相似，同一個體不同時期穩定性較高，但當個體出現問題時腸道優勢菌群結構有一定波動。2011年，楊柳等[5]采用ERIC-PCR與DGGE相結合的方式，分析了榮昌豬腸道微生物群落特征，并與外源品種豬（長白、杜洛克）的腸道微生物群落進行比較，發現母豬哺乳對仔豬腸道微生物的影響明顯，且不同品種豬的腸道優勢菌差異較大。2013年，崔明全等[6]分析了一只野生大熊貓和不同年齡段圈養大熊貓糞便菌群的多樣性和相似性，發現大熊貓的腸道菌群多樣性容易受到生長環境、年齡因素的影響，并指出應用ERIC-PCR指紋圖譜優勢條帶鑒定優勢菌的方法有一定的局限性。孫杰等[7]采用常規菌群分析方法和ERIC-PCR技術對正常小鼠和抗生素相關性腹瀉小鼠進行了腸道菌群的檢測，驗證了ERIC-PCR技術的準確性，并發現陰性組和對照組腸道菌群的分布狀況存在明顯差異。

3.2 ERIC-PCR在病原菌分類上的應用 由于ERIC-PCR得到的圖譜穩定、重復性高，并能產生多種獨特的擴增產物，所以可以將細菌進行分型。1999年，Giovanni等[8]將ERIC-PCR技術應用到混合菌群和BIOLOG革蘭氏陰性菌群的群落結構分析上，得到了能夠反映菌群組成差異且穩定的指紋圖譜。ERIC指紋圖譜在李斯特菌種間及單增李斯特菌株間有很好的鑒別能力[9]。李鵬等[10]根據副豬嗜血桿菌15種血清型的特異性ERIC指紋圖譜，對中國東南部不同豬場的111株副豬嗜血桿菌樣品進行鑒定，得到了23種指紋圖譜，發現來自不同地區的分離株，其ERIC指紋圖譜也不同，說明副豬嗜血桿菌在中國東南部存在多種基因型，同時驗證了ERIC-PCR技術可用于對某一地區的細菌進行分子流行病學研究和基因型鑒定。

3.3 ERIC-PCR在追溯感染源上的應用 ERIC-PCR技術在確定疫病暴發或流行，追溯傳染源和控制腸道致病菌中也有非常重要的作用。2013年，宋玉財等[11]利用ERIC-PCR技術對比健康仔豬與黃白痢仔豬的糞樣樣品圖譜，發現健康仔豬糞樣與黃白痢仔豬的相比，ERIC-PCR圖譜相似性高，而且黃白痢仔豬腸道菌群中至少有一種類型的細菌異常增殖，這可能是造成仔豬黃白痢的原因。朱曉慧等[12]于2016年通過ERIC-PCR擴增比較了健康大鼠和水浸束縛應激大鼠的腸道微生物變化，發現急性應激后大鼠胃部和回腸的特征性條帶較少，而盲腸和結腸的特征性條帶較多，暗示干預急性應激可以從盲腸和結腸入手。曾波等[13]于2017年構建了不同周齡健康家兔及腹瀉家兔腸道微生物的ERIC-PCR指紋圖譜，分析二者腸道菌群結構的多樣性及其差異性，發現隨著家兔周齡的增加，健康家兔的腸道微生物菌群結構和多樣性發生了明顯變化；腹瀉兔與同一周齡的健康兔比較，腸道微生物菌群結構發生改變，多樣性降低，并出現了新的優勢菌群。這些研究結果為優化家兔飼養和預防疾病打下了基礎。

4 小結

綜上所述，利用ERIC-PCR分子生物學技術追蹤腸道微生物菌群結構特征和監測生物種群動態是一種高效簡單的手段，在流行病學調查上具有非常重要的價值。該技術可以從分子水平上對細菌群進行快速的鑒別分類，為人類更好地了解和監測動物腸道微生物穩態提供有力的依據，在探討微生物和動物健康方面有著廣闊的應用前景。

[1]Hulton C S J，Higgins C F，Sharp P M.ERIC sequences：a novel family of repetitive elements in the genomes ofEscherichia coli，Salmonella typhimuriumand other enterobacteria[J].Molecular Microbiology，1991，5（4）：825-834.

[2] Versalovic J，Koeuth T，Lupski R.Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes[J].Nucleic Acids research，1991，19（24）：6823-6831.

[3] 潘康成，陳正禮，崔恒敏，等.利用ERIC-PCR和PCRDGGE技術分析喂服枯草芽孢桿菌肉雞腸道菌群的多樣性[J].動物營養學報，2010，22（4）：985-991.

[4] 魯海峰，魏桂芳，李仲逵，等.ERIC-PCR分子雜交技術分析大熊貓腸道菌群結構[J].中國微生態學雜志，2005，17（2）：81-84.

[5] 楊柳，張邑帆，鄭華，等.榮昌、長白、杜洛克豬腸道微生物ERIC-PCR-DGGE指紋圖譜比較分析[J].家畜生態學報，2011，32（5）：21-25.

[6] 崔明全，何廷美，鐘志軍，等.大熊貓糞便菌群ERICPCR指紋圖譜的分析及優勢菌群的鑒定[J].畜牧與獸醫，2013，45（9）：6-11.

[7] 孫杰，孫麗妲，倫永志，等.基于ERIC-PCR指紋圖譜技術的小鼠腸道菌群失調分析方法的建立[J].中國微生態學雜志，2016，28（12）：1386-1388.

[8] Di Giovanni G D，Watrud L S，Seidler R J，et al.Fingerprinting of mixed bacterial strains and BIOLOG Gram-Negative（GN） substrate communities by enterobacterialrepetitive intergenic consensus sequence-PCR（ERIC-PCR）[J].Current Microbiology，1999，38（4）：217-223.

[9] 金莉莉，王秋雨，侯瀟.ERIC-PCR技術在李斯特氏菌種、菌株鑒定中的應用[J].遺傳，2003，25（2）：195-197.

[10] 李鵬，李軍星，李玉峰，等.中國東南部地區副豬嗜血桿菌分離株ERIC-PCR指紋圖譜分析[J].中國獸醫學報，2009，29（12）：1566-1570.

[11] 宋玉財，王彬，王俊卿，等.健康仔豬與黃白痢仔豬腸道菌群結構分析[J].湖北畜牧獸醫，2013，34（2）：21-22.

[12] 朱曉慧，張成崗，劉海峰.急性應激后大鼠胃腸道病理變化及其菌群ERIC-PCR圖譜分析[J].生物技術進展，2016，6（3）：200-205.

[13] 曾波，張智，李再新.家兔腸道微生物ERIC-PCR指紋圖譜構建及分析[J].南方農業學報，2017，48（1）：139-143.