植物細胞器內蛋白質量控制相關機理綜述

韓薛婧娉，胡盈盈，余 穎，王炫婷，徐 珂，祝妍瑾

（浙江師范大學初陽學院，浙江金華321000）

蛋白質是生物體生命活動的執行者，其結構和活性決定了功能強弱，最終影響生物體的活動。許多mRNA翻譯出的多肽鏈不具有生理活性，需要折疊、組裝成大分子蛋白質后才能在特定位點發揮其生物學功能。蛋白質翻譯過程出錯或蛋白質損傷是生物體內普遍發生的現象，但蛋白質受損更多情況下是由植物體內積累活性氧（ROS）的攻擊引起的，葉綠體、線粒體和過氧化物酶體等細胞器均能產生ROS。葉綠體光合代謝中，O2首先在光系統Ⅰ被還原為，在超氧化物歧化酶（SOD）的歧化作用下產生H2O2，H2O2如不能被及時清除，則會在Fe2+或Cu2+作用下，反應產生羥自由基（·OH）[1]。線粒體中，電子沿著電子傳遞鏈傳遞給末端氧化酶之前，離開呼吸鏈而與氧反應生成超氧自由基的過程是線粒體產生ROS的主要來源[2]。過氧化物酶體中，膜上NADH和NADPH受驅動會產生O2-，基質中，黃嘌呤氧化酶（XOD）催化黃嘌呤轉化為尿酸的反應中也會產生O2-，此外，芬頓反應（Fenton reaction）能產生·OH 和單線態氧（1O2）[3]。

植物在自然生長條件下極易受到干旱、鹽、熱等非生物脅迫，此時，植株內ROS的產生和清除平衡被打破，ROS大量積累[4]，由此引起植物細胞器甚至細胞的損傷和死亡，進而影響植物的正常生長發育。在農業上，嚴重的非生物脅迫可能導致作物生長緩慢、產量低下，影響經濟效益。

為了確保蛋白質的正常折疊、組裝、運輸和異常蛋白的修復、降解，植物體內存在嚴格的蛋白質量控制系統，以維持蛋白質的動態平衡。由于細胞器在細胞中扮演著非常重要的角色，因此，細胞器內蛋白質量控制也顯得尤為重要。當細胞器蛋白受到活性氧攻擊而出現損傷時，植物細胞器蛋白質量控制系統主要通過修復氧化蛋白和水解無法修復的蛋白2種途徑來保護自身正常生長。

1 植物細胞器蛋白氧化損傷及檢測

1.1 細胞器蛋白氧化損傷方式

ROS對蛋白質的氧化損傷體現在很多方面，ROS能使蛋白質巰基氧化成二硫鍵（P-S-S-P）和谷胱甘肽二硫鍵（P-S-S-G），因此，多數催化中心為巰基的蛋白質失活。此外，氧化蛋白可能含有活性基團，因而，有機會造成其他生物分子的二次氧化損傷[5]。ROS對蛋白質的損傷機理主要有5個方面：修飾氨基酸，斷裂肽鏈，形成交聯聚合物，改變構象和產生免疫原性。

1.1.1 修飾氨基酸 不同自由基會特異性修飾氨基酸，其中，含不飽和鍵的氨基酸對氧化損傷特別敏感，且氨基酸被破壞的程度與自由基的摩爾濃度呈正相關[6]?！H是化學性質最活潑的活性氧，幾乎能與所有的氨基酸反應，如可氧化精氨酸（Arg）為谷氨酸（Glu）或谷氨酸半醛殘基等[7]。

1.1.2 斷裂肽鏈 自由基主要通過水解肽鍵和直接斷裂2種方式導致肽鏈斷裂。自由基攻擊氨基酸的肽鍵可導致其共價鍵解開，以含脯氨酸（Pro）的肽鏈為例，ROS的攻擊會導致羰基生成，進而轉化為α-吡咯烷酮，α-吡咯烷酮水解后便與相鄰氨基酸斷開。肽鏈直接斷裂過程為·OH在有氧參與時，帶走α碳原子上的H，形成過氧基，酸性條件下，肽鍵轉變成亞氨基肽，水解斷裂[8]。

1.1.3 形成交聯聚合物 多種機制均可導致蛋白質的交聯聚合。如：被氧化后，酪氨酸（Tyr）形成二酪氨酸，半肽氨酸（Cys）生成二硫鍵，均可以使蛋白質交聯聚合[9]。當蛋白質接觸·OH后，生成大量雙酪氨酸，且可以交聯方式與Tyr和Cys數目密切相關。

1.1.4 改變構象 蛋白質氧化修飾過程常伴隨肽鍵斷裂、蛋白分子交聯聚合等過程，其分子結構在熱動力學上不穩定，進而改變蛋白質高級結構，蛋白質失活。研究發現，·OH可改變谷氨酞胺合成酶的高級結構[10]。

1.1.5 蛋白質免疫學性質的改變 活性氧可引起免疫反應增強，其原因可能是ROS與自身某些免疫性疾病中抗原抗體復合物的形成有關[8]。

1.2 蛋白質量檢測指標

為了判斷蛋白質量，比較常用的指標有羰基化蛋白質量、游離巰基含量、蛋白質分子表面疏水性、蛋白內源熒光光譜、蛋白聚集程度等。

在引起蛋白質氧化損傷的反應中，肽骨架斷裂、氨基酸側鏈氧化等都與新生成的蛋白質羰基有關，自由基氧化多肽成羰基這一現象比較普遍，因此，羰基含量被作為判斷蛋白質氧化損傷程度的一個重要指標[11-12]。在穩定蛋白質分子構象上，二硫鍵和巰基發揮了非常重要的作用[13]，氧化可以改變巰基/二硫鍵交互反應的平衡常數，也能改變蛋白質分子中巰基和二硫鍵的比例及分布[14]，游離巰基含量由此可作為評價蛋白質氧化水平的指標。表面疏水性對蛋白質的理化性質和功能特性有重要影響[15]，因此，可用來衡量蛋白質變性程度，不僅反映表面疏水性基團的相對含量，還反映蛋白位點的細微變化。蛋白熒光反映蛋白質量，尤其體現在最容易被氧化的色氨酸（Ser）上，Ser殘基極易被轉化為亞穩態的自由基、過氧自由基、犬尿氨酸，使得內源熒光強度下降[16]。蛋白聚集程度也是體現蛋白質量的一個指標，可通過蛋白質的溶解度來進行簡單表征。

2 植物細胞器氧化蛋白修復

合適的生理環境是細胞生存和發揮功能的必要條件，在維持著體內氧化還原穩態方面，硫氧還蛋白家族有重要作用。該家族包括蛋白質谷氧還蛋白（GRX）、硫氧還蛋白（TRX）和二硫鍵異構酶（PDI），其中前兩者更為重要[17]。由于自身氧化還原電位不同，生物體內GRX和TRX多作為還原劑，而PDI多作為氧化劑。

2.1 谷氧還蛋白系統

該系統由GRX、還原型輔酶Ⅱ（NADPH）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽（GSH）構成。電子從NADPH向GR，GSH傳遞，最后到GRX。谷氧還蛋白通過還原過氧化氫酶、脫氫抗壞血酸[18]等多種途徑介入氧化應激過程。

GRX依賴于GSH催化巰基-二硫鍵的轉換反應，對和GSH相連的二硫化物有高度的底物特異性。GRX催化機制可分為單巰基催化和二巰基催化2種。單巰基催化指GRX催化還原與GSH相連的二硫鍵，N端Cys的巰基作用于目的蛋白二硫鍵，生成反應中間體P-SH和GRX-S-S-G，后者的二硫鍵被第2個分子的GSH還原，生成GRXreduced和GSSG。二巰基催化指GRX催化還原蛋白質二硫鍵，GRX活性中心N端Cys的巰基作用于二硫鍵，生成中間產物，GRX的C端Cys的巰基攻擊產物的二硫鍵，生成P-SH和GRXoxidized。GSH攻擊后者分子內二硫鍵，GSH和活性中心N端Cys的巰基新生成二硫鍵，形成GRX-S-S-G復合物。最后，GSH攻擊復合物的二硫鍵，生成GSSG和GRXreduced。

2.2 硫氧還蛋白系統

TRX在氧脅迫反應中作用很大，它可還原具有修復氧化蛋白功能的酶，如過氧化物酶、蛋氨酸硫氧化物還原酶等。

硫氧還蛋白系統由NADPH、硫氧還蛋白還原酶（TR）、硫氧還蛋白構成。TR可催化氧化型的TRX被還原。真核細胞中的TRX被一種依賴于NADPH的TR（NTR）還原；在色素體和藍細菌中，TRX被依賴于FAD的TR（FTR）還原。

TRX催化反應過程主要為：活性中心N端的巰基攻擊目的蛋白的二硫鍵，形成中間體TRX-protein，后被C端的巰基還原，生成氧化態TRX和還原態目的蛋白，TRX最后被相應的還原酶還原。

3 植物細胞器氧化蛋白清除

3.1 氧化蛋白的酶降解

受到損傷的蛋白質需要通過蛋白酶除去。蛋白酶廣泛分布于生物細胞中，主要作用對象是肽鍵，作用包括五大類：清除錯誤折疊、修飾和定位的蛋白；供給氨基酸；激活酶原；調控關鍵酶及調節蛋白含量；除去已定位蛋白信號。在細胞質和細胞核中行使降解氧化蛋白質功能的主要是26S蛋白酶體，在細胞器中行使該功能的蛋白酶有ClpP蛋白酶、Lon蛋白酶等。

3.1.1 ClpP蛋白酶 ClpP蛋白酶廣泛存在于各種生物體中，目前在擬南芥中已發現了6個ClpP蛋白異構體（ClpP1-6），其中，僅ClpP2定位于線粒體，其他均在葉綠體中。

ClpP需要與分子伴侶（如ClpA，ClpE和ClpX等）組合成復合物，才能發揮蛋白酶的作用：捕獲目的蛋白，利用ATP高能磷酸鍵斷裂產生能量將底物蛋白結構松散后轉移至ClpP，將多肽水解為小的肽段后釋放。此外，Clp復合物的2個亞基分離時也可發揮一定功能。

3.1.2 Lon蛋白酶 Lon蛋白酶是細胞器中蛋白質質量控制的最主要成分，高度保守，具有分子伴侶及調控蛋白質降解等功能。

擬南芥中存在4個Lon蛋白酶，分別為Lon1，Lon2，Lon3和Lon4蛋白酶。其中，Lon1和Lon4蛋白酶既定位于線粒體中，又定位于葉綠體中，參與線粒體功能的維護以及ABA信號途徑中的蛋白降解、葉綠體自愿響應和幫助抵御干旱脅迫；Lon2定位于過氧化物酶體中，研究表明，Lon2蛋白酶可有效清除過氧化物酶體中的氧化蛋白質，且可能還具有調控過氧化物酶體中抗氧化酶酶活的能力；Lon3為假基因，是Lon基因家族成員中唯一具有潛在核定位信號的基因。

3.2 自體吞噬空泡對氧化蛋白的清除

除酶降解外，植物細胞器氧化蛋白清除還有一個重要途徑是細胞自噬，該途徑對氧化蛋白具有較高的清除效率。自體吞噬是指細胞質的成分在液泡或溶酶體中被降解的過程，其分子機制在高等真核生物中保守性較高。自體吞噬包含微型和巨型2種主要形式。微型自體吞噬指細胞質的成分被胞吞進入細胞器，即溶酶體或者液泡內膜直接包裹底物并降解。巨型自體吞噬則是胞質成分先由雙層膜結構包圍，形成自吞噬體，之后其外膜與溶酶體、液泡膜融合，通過胞吞方式進入溶酶體或液泡中，最終將其降解。

4 總結與展望

植物細胞器在受到脅迫時將產生大量活性氧，不僅損傷細胞器自身，活性氧還可通過自由擴散進入細胞內，對細胞其他部位產生影響。蛋白質是極易受氧化損傷的生物大分子，其損傷將嚴重影響細胞器甚至細胞的正常生命活動。目前，植物細胞器中已經發現了多種蛋白質量控制方式。但由于蛋白質量控制的復雜性，許多具體機制仍處于研究探索階段，尚不完整。此外，細胞器水平的蛋白質量控制與細胞水平的蛋白修復和清除機制之間的內在聯系也尚未研究清楚。這些相關機制的深入探究和完善將為農作物育種等方面的研究提供理論參考。