脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白生物學(xué)功能及其在小麥中的研究進展

魯晉秀 ，閆秋艷 ，李 倩 ，聶園軍 ，楊 峰

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，山西臨汾041000；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟研究所，山西太原030006）

植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白（lipid transfer protein，LTP）是一類可溶性的小分子蛋白，因其能夠轉(zhuǎn)運脂類物質(zhì)而得名。LTP蛋白N端有一個包含21～29個氨基酸的信號肽，能夠引導(dǎo)蛋白分泌到細胞外參與細胞外親脂性物質(zhì)（如角質(zhì)）的沉積途徑[1]。LTP蛋白含有8個半胱氨酸殘基（C-Xn-C-Xn-CC-Xn-CXCXn-C-Xn-C），可以形成4個二硫鍵[2]。體外試驗表明，這4個二硫鍵形成一個疏水腔，因而能夠結(jié)合脂類和一些疏水性物質(zhì)[3]。不同物種的LTP蛋白一級結(jié)構(gòu)差異較大，根據(jù)其分子量大小最初將其分為LTP I和LTP II共2個亞家族，其中，LTP I分子質(zhì)量大約為10 ku，由90～95個氨基酸殘基組成；LTP II分子質(zhì)量大約為7 ku，由70個氨基酸組成。2個亞家族都含有保守的8個半光氨基酸殘基，其形成二硫鍵的配對方式不同：LTP I家族中半胱氨酸殘基配對組合為 1-6，2-3，4-7 和 5-8，LTP II家族中半胱氨酸殘基配對組合為1-5，2-3，4-7和6-8。后來在玉米中發(fā)現(xiàn)了花藥特異性轉(zhuǎn)錄基因MZm3-3，該基因表達的蛋白與nsLTPs同源，被認為是TypeIII[4]。BOUTROT等[5]通過系統(tǒng)進化樹分析將水稻和擬南芥的nsLTPs分為9種類型（type），不同類型可以通過8個半胱氨酸之間的氨基酸數(shù)目來區(qū)分。

1 LTP研究進展

1.1 LTP克隆

植物L(fēng)TP首次從菠菜葉中分離[6]，隨后其他不同植物L(fēng)TP成員也相繼被報道。目前，已經(jīng)從多種植物中分離到LTPs基因，在小麥中鑒定出23個LTP基因[7]，在棉花中已分離到11個LTP基因[8]，在擬南芥中分離到15個LTP基因[9]，而近來對水稻全基因組序列的分析發(fā)現(xiàn)，在水稻中存在52個脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白基因[5]。

1.2 LTP定位和表達

脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白是在植物中發(fā)現(xiàn)的一類小分子蛋白家族，其細胞定位也比較復(fù)雜，免疫定位研究表明，AtLTP1存在于細胞壁中[10]，在玉米胚芽鞘的表皮細胞中也發(fā)現(xiàn)有LTP的存在[11]。

通過Northern blot實驗、原位雜交以及對轉(zhuǎn)基因植物中LTP-GUS融合蛋白的GUS活性檢測等技術(shù)，對LTP的表達進行了研究，發(fā)現(xiàn)不同植物L(fēng)TP在時間和空間上表現(xiàn)出復(fù)雜的表達模式，同一植物的不同LTP可能有其特有的表達模式。在大麥中發(fā)現(xiàn)的2個幼苗特異性表達LTP基因，一個在幼苗葉片中的表達量要高于胚芽鞘，而另一個表達恰好相反[12]。蓖麻中l(wèi)tpC1和ltpC2在子葉中表達，而ltpD則在胚軸中表達[13]。通過研究發(fā)現(xiàn)，LTP主要存在于植物的地上部分，如植物的葉、莖和芽的分生組織中，但在根中沒有檢測到LTP基因的表達[6，14-15]。

有研究在青花菜中發(fā)現(xiàn)，LTP與葉片中角質(zhì)層蠟質(zhì)合成有關(guān)，免疫分析發(fā)現(xiàn)其蛋白的50%在幼葉中表達，隨著葉片的老化蛋白含量降低至4%，上述結(jié)果表明，LTP和轉(zhuǎn)運角質(zhì)單體以及角質(zhì)合成有關(guān)[16]。對AtLTP1基因的研究也表明，其在正在發(fā)育的幼嫩組織中的表達量要高于成熟的組織[17]，在胡蘿卜的胚胎細胞中發(fā)現(xiàn)的EP2基因?qū)儆贚TP家族，該基因在胚細胞、莖尖、發(fā)育的花以及成熟種子的種皮和果皮中表達，有運輸角質(zhì)單體的功能，這對形成胚的脂質(zhì)層是非常必要的[18]。

在植物花和花器官中也檢測到有LTP基因的表達，比如LTP基因在擬南芥正在發(fā)育的花序中有較高的轉(zhuǎn)錄水平，研究還發(fā)現(xiàn)，在煙草的萼片[14]、花椰菜的花蕾[15]以及油菜籽的小孢子[19]中都有LTP基因的表達。

1.3 LTP生物學(xué)功能

1.3.1 角質(zhì)層蠟質(zhì)合成和胚胎發(fā)育 由于信號肽的存在，使得蛋白能夠分泌到細胞外參與親脂性物質(zhì)比如角質(zhì)的沉積，LTP蛋白能夠結(jié)合酰基鏈單體，這在角質(zhì)合成過程中起到重要作用[1]。擬南芥中發(fā)現(xiàn)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白LTPG參與角質(zhì)的合成，該基因突變導(dǎo)致莖表皮細胞角質(zhì)層蠟質(zhì)組成發(fā)生變化以及蠟質(zhì)積累減少[20]。煙草中LTP基因表達量上升，從而使葉片的角質(zhì)層蠟質(zhì)積累增加[21]。上述結(jié)果均表明，LTP參與植物角質(zhì)層蠟質(zhì)運輸和積累。研究發(fā)現(xiàn)，LTP在幼胚中有很高的表達量，推測LTP可能在胚胎發(fā)育早期保護層形成中起到重要作用[18]。1.3.2 生殖器官發(fā)育 ARIIZUMI[22]在花粉發(fā)育階段的絨氈層細胞檢測到擬南芥脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白AtLTP12基因的表達，認為該基因能夠在花粉發(fā)育過程中從絨氈層向花粉外壁傳遞脂質(zhì)。水稻OsC6編碼一種脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白基因，在絨氈層細胞中有很高的表達量。研究發(fā)現(xiàn)，RNAi干擾OsC6基因表達，轉(zhuǎn)基因水稻的花藥細胞表現(xiàn)出絨氈層不能降解，從而降低了花粉的育性[23]。

1.3.3 病原菌的防御 LTPS蛋白與植物抗病相關(guān)，在受到病原菌誘導(dǎo)時基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上升，其蛋白能使植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[24]。例如，從大麥葉片中得到的純化LTP-like蛋白以及從玉米中分離出的LTP對細菌性病原體和真菌生長起到了抑制作用。在煙草中過表達小麥ltp3F1，能夠提高煙草對真菌病害的抗性。SUN等[25]研究認為，LTP能夠結(jié)合磷脂使真菌病原體的細胞膜通透性發(fā)生改變。MALDONADO等[26]通過篩選一系列擬南芥突變體是否產(chǎn)生SAR特異應(yīng)答時，得到了1個對假單胞菌有局部抗性的缺陷型誘導(dǎo)抗性基因dir1-1，其中，dir1-1編碼LTP，因此，推測DIR1能夠和脂類物質(zhì)相互作用，促進信號遠距離傳導(dǎo)，進而表現(xiàn)為對病原體的抗性。但在近期的研究中發(fā)現(xiàn)，擬南芥中AtLTP3能夠增加體內(nèi)ABA的合成，從而提高植株對病原菌的易感性[27]。

1.3.4 抗非生物脅迫 已有研究證明，LTP與植物防御反應(yīng)激發(fā)子elicitin[28]在結(jié)構(gòu)和功能特性上有些類似，能夠與植物控制防御反應(yīng)的受體相結(jié)合，因此可推測脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白在植物受到脅迫反應(yīng)的早期即發(fā)揮作用。作為一種防御蛋白，LTP基因的表達量常受到干旱、鹽脅迫等處理的影響。比如，芝麻SiLTP2與SiLTP4基因的表達受NaCl、甘露醇等脅迫的誘導(dǎo)[29]。擬南芥中過表達脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白基因AZI1株系的耐鹽性明顯高于野生型和突變體株系[30]。干旱處理后的雀麥草LTP基因在復(fù)水3 d后表達量加倍[31]。過表達辣椒CALTP1的轉(zhuǎn)基因擬南芥抗鹽和抗旱性能比野生型顯著提高[32]。

2 LTP在小麥中的研究動態(tài)

2.1 表達譜的研究

LTP作為小分子家族，在基因序列上保守，其基因表達上卻表現(xiàn)各異，例如JANG等[33]在小麥-黑麥易位系2BS/2RL中克隆到2個LTP家族基因LTP1和LTP2，Northern blot分析表明，在植株的葉片、莖和花冠中表達，原位雜交進一步表明，LTP1和LTP2在葉片細胞的維管束和花冠細胞的維管束組織層中表達。BOUTROT等[7]用GUS作為報告基因，同樣在轉(zhuǎn)基因水稻根、葉和花的維管組織中檢測到6個小麥LTP基因啟動子活性，進一步說明，LTP在維管組織中發(fā)揮一定作用。YU等[34]從小麥3B，3D和5D染色體上分離出3個I類型的LTP基因，研究表明，這3個基因在轉(zhuǎn)基因煙草的細胞質(zhì)中表達，同時還發(fā)現(xiàn)，TaLTPId.1在葉綠體中也有少量表達。

2.2 生物脅迫的研究

LTP家族蛋白長期以來被歸類為PR（pathogenesis-related）家族的成員，因此，其在植物防御病原菌方面發(fā)揮一定作用[35]。例如SUN等[25]從小麥中克隆了9個ns-LTP基因的cDNA，研究發(fā)現(xiàn)，它們在體外能夠抑制致病病原菌的生長；過表達TaLTP5基因的轉(zhuǎn)基因小麥對赤霉病和根腐病具有一定的抗性[36]。過表達小麥脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白基因TdLTP4的擬南芥對真菌抗性有顯著提高[37]。目前有研究表明，并不是所有家族成員均有抗病性作用，如TaDIR1-2基因，與擬南芥脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白基因AtDIR1同源，通過基因沉默的方法敲除小麥中TaDIR1-2基因，結(jié)果顯示，該轉(zhuǎn)基因小麥對條銹病的抗性顯著增加，表明TaDIR1-2基因通過改變ROS或者水楊酸信號途徑對抗病性起到負調(diào)控作用[38]。

2.3 抗非生物脅迫研究

LTP作為一種防御蛋白，在小麥中同樣被檢測到在植株抵抗非生物脅迫過程中發(fā)揮一定作用。JANG 等[33，39]通過 Northern blot分析表明，LTP1 和LTP2基因在ABA和冷脅迫處理植株24 h后表達量升高，干旱處理3 d后表達量升高。原位雜交試驗進一步表明，在植株花冠細胞的維管束組織層中干旱處理植株的基因表達量高于對照植株，認為由于植株缺水導(dǎo)致維管束組織層被破壞，而LTP基因此時表達量升高，從而推測在干旱脅迫下LTP能夠保護維管束組織層細胞。YU等[34]分離出3個I類型家族的LTP基因，研究表明，TaLTPIb.1和TaLTPIb.5基因在受到干旱和冷脅迫后表達量均升高，而在黑暗處理后表達量不變，而TaLTPId.1在黑暗處理后表達量卻有上升趨勢。進一步研究表明，在過表達擬南芥中發(fā)現(xiàn)，冷脅迫條件下增加了3個轉(zhuǎn)基因植株的根長，TaLTPId.1基因在表達上的不同可能是因為家族基因亞功能化的原因。HELA等[37]從小麥中分離的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白基因TdLTP4，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在NaCl，ABA，JA和H2O2脅迫過程中比野生型表現(xiàn)優(yōu)越，過量表達小麥TaLTP3的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐熱性和氧化應(yīng)激反應(yīng)比野生型有所提高[40]。LI等通過同源克隆在小麥中獲得LTP基因，過表達轉(zhuǎn)基因植株發(fā)現(xiàn)，該基因能夠提高植株抗鹽脅迫能力[41]。

3 展望

小麥是世界上主要的糧食作物之一，在我國小麥播種面積約占糧食作物的27%，在糧食生產(chǎn)中具有舉足輕重的作用[42]，而其生長發(fā)育易受到病蟲害等生物脅迫與干旱、鹽堿和低溫等非生物脅迫的影響。作為世界上主要的農(nóng)作物，小麥抗逆性研究和抗逆育種成為當(dāng)今研究的重要課題。而脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白在植物生物脅迫和非生物脅迫方面均發(fā)揮一定的作用，迄今為止，人們對其作用機制研究得不是很透徹，但隨著科技的發(fā)展，人們將會通過深入研究和利用LTP蛋白作用機制，為充分發(fā)揮其基因功能對改良小麥等糧食作物奠定基礎(chǔ)。