低4-甲基咪唑焦糖色素制備工藝優化

婁迎霞,張安安,程 雷,孫寶國,王成濤,張 嬋,*

(1.北京市飼料監察所,北京 100107; 2.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心,北京工商大學,北京 100048)

焦糖色素(Caramel Color;CNS:08.108-110;INS:150a,b,c,d)俗稱“醬色”,是一種在食品工業中使用量最大的天然著色劑[1-4]。氨(銨)法焦糖色素是指在加工過程中沒有使用亞硫酸鹽而僅采用氨或銨鹽作為催化劑制成的一類焦糖色素[5],在食品中使用范圍較廣,用量較大,為目前國內焦糖生產的主流方式[6]。由于氨(銨)法焦糖色素在制備過程中,銨離子參與美拉德反應會產生一定量的4-甲基咪唑(4-methylimidazole,4-MeI),曾被禁止在食品中添加。后經研究和試驗認為氨法焦糖色素中4-MeI的含量不會超過每日攝入量(200 ppm)[7-10],作為色素在食品中添加是安全的。我國于 1988 年在新制定的焦糖色素國家標準(GB 8817-88)中恢復了氨法焦糖色素的使用。

隨著人們對食品安全問題越來越關注,近年來焦糖產品中存在4-甲基咪唑的問題使該產業的發展受到限制,因此研究低4-MeI焦糖色素產品成為近年來新的研究熱點。目前的研究多關注在低4-甲基咪唑的制備[11-14]及焦糖色素與其相關食品和調味品中4-甲基咪唑含量的測定[15-18]。市售氨法焦糖色素色率多為3.2～5.0×104,紅色素指數并無要求[19]。焦糖色素的色率和紅色素指數限制了低4-甲基咪唑產品在市場中的廣泛應用,因此,在關注低4-甲基咪唑生成的同時,尚需保證焦糖色素的色率和紅色素指數。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

4-甲基咪唑標準品、4-甲基咪唑-d3標準品 百靈威科技有限公司,色譜純;乙腈 賽默飛世爾科技(中國)有限公司,色譜純;氨水 天津光復化學試劑有限公司,色譜純;葡萄糖、碳酸銨 國藥集團化學試劑有限公司,分析純。

1290高效液相色譜儀、6460三重四級桿串聯質譜儀、C18Extend色譜柱(100×4.6 mm,5 μm) 美國Agilent公司;4523高壓反應釜 美國Parr設備公司;UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司;Free Zone真空冷凍干燥機 美國Labconco公司;DHG-9145電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司;AL204分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.3 正交試驗設計優化焦糖色素氨法制備工藝 選擇反應溫度、反應時間、碳酸銨濃度、葡萄糖濃度進行四因素三水平試驗,為減少試驗誤差,選擇L18(37)正交表進行正交試驗設計。對各單因素進行分析,以水平值為橫坐標,同一水平對應的試驗結果的算術平均數為縱坐標繪制趨勢圖,根據各單因素對氨法焦糖色素各考察指標的趨勢圖選擇最佳生產工藝(見表1)。

表1 氨法焦糖色素生產工藝因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal array design

1.2.4 指標測定

1.2.4.1 感官評定及指標評價 根據GB 1886.64-2015食品安全國家標準食品添加劑焦糖色[21]進行感官評定。

1.2.4.2 色率測定 參照文獻[22],利用真空冷凍干燥機去除液態焦糖色素中的水分,稱取1.000 g(±0.002 g)焦糖色素凍干粉,經水溶解、稀釋制得0.1%濃度樣液,10000 r/min離心10 min,取上清液,測得610 nm波長處吸光值,重復三次測定,取其平均值 A1,按式(1)計算色率(EBC):

色率(EBC單位)=A1×20000/0.076

式(1)

其中,EBC單位的意義為:當于610 nm處,光密度為0.076時,設定為20000 EBC單位。

1.2.4.3 紅色素指數測定 參照文獻[22],對上述色率測定樣液,用紫外可見分光光度計分別在610 nm和510 nm波長下,測定吸光度A1、A2,按式(2)計算焦糖色素紅色指數:

紅色指數=10×lg(A2/A1)

式(2)

式中:A1為610 nm處的吸光值,A2為510 nm處的吸光值。

1.2.4.4 4-甲基咪唑含量的測定[23]準確稱取10 mg 4-MeI和4-MeI-d3標準品于100 mL棕色容量瓶中,制得100 μg/mL濃度的標準儲備液,密封保存于4 ℃冰箱中。測定時將4-MeI標準儲備液,梯度稀釋,得到0.05～5.0 μg/mL的4-MeI標準品溶液,繪制標準工作曲線,采用內標法定量。以4-MeI-d3作為內標物,內標濃度為1 μg/mL。

對焦糖產品進行200倍的稀釋處理,并加入濃度為1 μg/mL的4-MeI-d3,10000 r/min離心5 min,取上清液過 0.22 μm微孔濾膜,上機檢測。

HPLC檢測部分的參數設定:高效液相色譜儀:Agilent1290;色譜柱:Agilent C18,Extend 100×4.6 mm,5 μm;流動相:A:乙腈,B:含有0.2%氨水的超純水。按照如下條件進行梯度洗脫:0 min:35∶65(A∶B);3 min:35∶65;4 min:50∶50;8 min:65∶35;12 min:50∶50;13 min:35∶65;16 min:35∶65。流速:0.2 mL/min;柱溫:38 ℃;進樣量1 μL。

三重四級桿串聯質譜參數設定:QQQ型號:Agilent 6460;離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描模式:正離子模式;掃描質量范圍:m/z 20～200 aum;噴霧器壓力:15.0 psi;干燥氣:氮氣;溫度:300 ℃;流速:10.0 L/min。

分別對4-MeI標準溶液和處理好的焦糖色素樣液進行檢測。采用內標法進行定量,標準工作曲線為y=0.743620x+7.654302E-04,R2=0.999。

1.3 數據處理

實驗操作重復三次,采用Excel軟件進行數據計算和繪圖。

2 結果與分析

2.1 感官評價結果

全文制備的焦糖色素均為性狀均一的黑褐色液體,無雜質,肉眼觀察無明顯不溶固形物,將其稀釋成10 g/L水溶液具有焦香味,滿足實際生產需求,因此感官評定結果不作為主要考察指標。

2.2 單因素的選擇

2.2.1 反應溫度對焦糖色素的影響 色率和4-MeI含量隨著反應溫度升高而增加,紅色指數則與之相反。焦糖化反應過程中單糖在pH<7.0時,加熱進行脫水生成糠醛或其衍生物[24-25],兩類物質互相聚合或與胺類反應生成深褐色物質,提高色率,反應溫度>80 ℃,美拉德反應褐變速度受溫度影響較小[26]。4-MeI是美拉德反應的副產物,隨著溫度的升高,4-MeI的量也不斷增多,因此過高的溫度不利于4-MeI的生成控制。由圖1可知在125～145 ℃范圍內色率數值較高,145 ℃時達到最大值,115 ℃時紅色素指數最高,4-MeI含量最低。綜合考察反應溫度對產品特性的影響,選擇 125、135、145 ℃三個水平。

圖1 反應溫度對氨法焦糖色素品質的影響Fig.1 Effects of reaction temperature on caramel color quality

2.2.2 反應時間對焦糖色素的影響 對制備好的焦糖色素進行指標測定,結果發現反應時間的變化對焦糖品質有著重要的影響。圖2結果顯示:反應時間的增加使焦糖色率和4-MeI含量有了明顯的提升,說明隨著反應時間的延長成色物質及4-MeI不斷的積累。隨著反應時間的延長,焦糖色素的紅色素指數有所降低。為了避免4-MeI的過度積累,保證焦糖色素良好的紅色色調,綜合考慮后,因此選擇 60、80、100 min三個時間作為正交試驗設計的水平。

圖2 反應時間對氨法焦糖色素品質的影響Fig.2 Effects of reaction time on caramel color quality

2.2.3 催化劑濃度對焦糖色素的影響 圖3結果顯示碳酸銨濃度對4-MeI含量及紅色素指數的影響較為明顯,對色率影響較弱。碳酸銨濃度>4%時,色率的增加趨勢變得平緩,在8%處再次突然升高。受碳酸銨濃度增加的影響紅色指數降低。4-MeI含量隨碳酸銨濃度增加不斷升高,這是由于碳酸銨提供了體系中丙酮醛氨解所需的NH3為4-MeI生成提供必要條件[27]。主要考慮4-MeI含量及紅色素指數兩個因素,選擇3%、4%和5%三個碳酸銨濃度進行試驗。

圖3 (NH4)2CO3濃度對氨法焦糖色素品質的影響Fig.3 Effects of concentration of

2.2.4 葡萄糖濃度對焦糖色素的影響 由圖4發現,葡萄糖濃度的變化對各評價指標的影響較小,且趨勢與其它因素影響結果相似。葡萄糖濃度>500 g/L時,對色率的影響不顯著。葡萄糖提供了反應所需的糖類物質,濃度增加會使反應產生的呈色物質增加,達到500 g/L濃度時反應物接近飽和,因此對色率無顯著影響。紅色素指數受葡萄糖濃度變化的影響不明顯。當葡萄糖濃度在200～400 g/L時,4-MeI含量隨葡萄糖濃度增加而加大;當葡萄糖濃度在500～700 g/L時,4-MeI含量不隨葡萄糖濃度變化而變化。葡萄糖作為反應的主原料,隨著濃度的增加會提高反應后各物質的產量,當原料濃度達到飽和后,對反應的影響并不明顯,因此選擇400、500和600 g/L進行單因素試驗。

圖4 葡萄糖濃度對氨法焦糖色素品質的影響Fig.4 Effects of concentration of glucose on caramel color quality

2.3 正交試驗

2.3.1 因素水平選擇 在單因素試驗結果基礎上,選擇反應溫度、反應時間、碳酸銨濃度、葡萄糖濃度進行四因素三水平試驗,為減少誤差特設誤差列,選擇L18(37)正交表進行正交試驗設計(見表2)。并將優化結果與初始條件制備的焦糖色素進行比較,初始焦糖色素的色率6.32×104EBC,紅色素指數5.07,4-甲基咪唑的含量256.63 μg/mL。

2.3.2 正交試驗結果 按表1進行正交試驗設計,結果見表2。

表2 焦糖色素氨法工藝優化L18(37)正交表試驗結果表Table 2 Results of L18(37)orthogonal array design

2.4 方差分析

試驗結果顯示反應溫度、反應時間、催化劑濃度對焦糖色素的色率、紅色素指數和4-甲基咪唑含量影響較為明顯,而葡萄糖濃度對焦糖色素品質影響不大。因此對各因素對不同指標的影響效果分別進行分析。以焦糖色率為因變量進行反應溫度、時間、催化劑濃度和葡萄糖濃度的主體間效應檢驗,經檢驗分析發現各因素間無交互作用,采用單因素方差分析。

2.4.1 各因素對焦糖色素色率的影響 由表3可知:反應溫度主體效應F值為349.566,p值為0.000,反應時間的p值為0.020,表明二者對色率影響顯著(p<0.05);葡萄糖濃度和催化劑濃度的變化對色率均無顯著影響(p>0.05)。同時,誤差列對試驗結果無影響。

表3 各因素對焦糖色素色率影響方差分析結果Table 3 Results of one-way analysis of variance

以焦糖紅色素指數為因變量進行各因素主體間效應檢驗。結果見表4,反應溫度對色率紅色素指數影響顯著(p=0.001),其余因素對焦糖色素紅色素指數影響不大(p>0.05)。

表4 各因素對焦糖色素紅色素指數影響方差分析結果Table 4 Results of one-way analysis of variance

經方差分析(結果見表5)可知:反應溫度和碳酸銨濃度對焦糖色素中4-甲基咪唑生產的影響顯著(p<0.05),反應時間和葡萄糖濃度對4-甲基咪唑生成無顯著影響(p>0.05);各誤差列對試驗結果無影響。

表5 各因素對焦糖色素中4-甲基咪唑 含量影響方差分析結果Table 5 Results of one-way analysis of variance

根據方差分析可知,反應溫度對三個考察指標均有顯著影響(p<0.05),反應時間、碳酸銨濃度分別對色率、4-甲基咪唑含量具有顯著影響(p<0.05)。由此可見,最優生產工藝的確定應主要對反應溫度、反應時間和碳酸銨濃度進行篩選。焦糖色素作為一種天然色素在食品中添加使用,應以色率、紅色素指數為主要考察,同時篩選出4-甲基咪唑含量低的優質產品。因為各因素對焦糖色素色率的影響趨勢與各因素對紅色素指數、4-甲基咪唑含量影響趨向相反，所以對最佳生產工藝的選擇很困難。色率高要求高溫長時間多葡萄糖進行反應，但溫度過高導致焦糖色素顏色發黑，色調不好，同時還會促使4-甲基咪唑的生成；紅色素指數高，色調好且4-甲基咪唑含量低的產品要求低溫短時間反應，但是色率無法保證，又降低了焦糖色素的生產效率。

本工藝的優化不僅有效降低了4-甲基咪唑的生成,更對焦糖色素的感官、性狀、色率、色調等天然色素的主要應用指標進行優化分析。

3 討論與結論