VA菌根真菌不同接種體數量盆栽擴繁試驗

韋中強++韓如剛++李娜++韓量++秦靜

摘要 為了探討藥用植物黃精根際土著AM菌根真菌地球囊霉孢子在人工接種條件下，不同接種體數量對擴繁試驗的影響，本文采用1%水瓊脂作為活性孢子萌發培養基，以三葉草為接種宿主，在宿主種植密度為10株/dm2條件下，分別采用單孢、4孢、20孢接種處理，研究繁殖體擴繁數量的變化。結果表明，單孢接種繁殖系數最高（4 200），4孢接種中等（1 562），20孢接種最低（365）；孢子產量則以20孢接種最高，4孢接種次之，單孢接種最小。可以看出，不同接種體擴繁效應存在顯著差異。該結果為土著AM真菌的純化及擴繁培養提供了簡易可行的途徑。

關鍵詞 藥用植物；黃精；土著AM真菌；擴繁；繁殖系數

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）03-0080-02

菌根（mycorrhiza）是自然界中一種普遍的植物共生現象。AM真菌在植物根際形成的龐大菌絲網絡系統能顯著促進作物礦物質養分和水分的吸收利用[1]，促進其生長發育，改善水分狀況，提高抗旱性、抗病性，增強作物對鹽堿和重金屬毒害的耐性，改良土壤，提高作物產量，改善品質，對實現植物根際土壤生態系統的可持續發展具有重要實踐價值[2-3]。近年來，菌根技術在農業上的開發利用已取得了進展，獲得了顯著經濟效益，越來越受到了世界各國的普遍關注。

我國VA菌根真菌資源豐富，生態適應性強，廣泛存在于各種生態環境中。AM真菌是專性活體營養微生物，在無宿主存在的離體培養中，目前的技術還不能使這些真菌完成整個生活史，由此成為進一步開發和利用AM真菌的重大障礙。但是由于AM真菌具有一定的無宿主發育能力，對人類有巨大的經濟效益和社會效益，促使研究人員開展了大量研究工作，希望能尋找到促進AM真菌在離體條件下可以完成其生活史的各種化學物質——AM真菌生長促進物質（stimulators），實現離體培養條件下完成AM真菌生活史的愿望，生產出高純度、無污染、低成本的商品AM菌劑。本試驗開展了AM真菌地球囊霉（G. geospora Gerdemann）的單孢及多孢擴繁試驗，現將結果總結如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

宿主植物：三葉草（Trifolium reperns）。AM菌劑：黃精根際土壤分離的VA菌根真菌地球囊霉（G. geospora Gerdemann）。盆栽缽：市場上購買的白色塑料缽，缽高16 cm，上口內徑18 cm，面積為254.34 cm2，底部內徑12 cm。

1.2 試驗設計

用AM真菌不同接種體（孢子）數量接種培養在特殊基質上的三葉草根系，即設3個處理，分別為單孢接種、4孢接種、20孢接種，6次重復。3個月后取培養基質提取分離新生孢子，統計分析產孢數量，確定繁殖效益。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養基的配制。取直徑7 cm洗凈的培養皿，倒入10 mL 1.0%水瓊脂培養基，5皿一組疊放，用雙層鋁箔將其包裹，高溫高壓（θ=121 ℃，φ=0.1 MPa）滅菌15 min，晾至室溫取出，移入接種箱內待用。

1.3.2 孢子表面消毒。采用濕篩傾斜法[4]分離提取的地球囊霉孢子，在光學解剖鏡下挑出細胞質均勻一致的生活孢子，42 KHz超聲波水浴振蕩片刻去掉孢子表面的雜物，蒸餾水漂洗數次后，將孢子轉入直徑為3.0 cm的小玻璃培養皿中移入接種箱內，滴加幾滴2%（W/V）氯銨T-200 mg/L鏈霉素-100 mg/L慶大霉素-吐溫20液[5]，蓋好上皿，進行孢子表面消毒15 min。與此同時，接種箱內盛有滅菌培養基的培養皿及所有用具也在紫外燈下表面滅菌15 min。

1.3.3 接種培養。2015年2月20日，將表面消毒后的孢子，經滅菌蒸餾水漂洗數次后，用特制的塑料小吸管分別將孢子接種在滅菌培養基表面，每皿分別接種1個、4個、20個孢子，孢子在皿中成均勻排布，用封口膜封固上下皿，20個重復。30 ℃暗箱培養10 d，絕大多數孢子萌發，待用。

1.3.4 盆栽基質的制備。取腐殖土和黃精園土，按體積比1∶1混合，pH值5.8、含磷量12.7 mg/kg、有機質含量4.12%。高溫高壓（θ=121 ℃，φ=0.1 MPa）滅菌2 h，晾至室溫取出備用。

1.3.5 接種盆栽培養。2015年3月1日，孢子經表面消毒后，在1%水瓊脂培養基上培養，選用萌發的單孢、4孢、20孢的地球囊霉孢子分別接種在播種有經表面消毒的三葉草種子的培養基質中，將培養10 d已經萌發的AM真菌孢子及其瓊脂培養物一并倒入已裝好的滅菌土的盆缽土表面以下5 cm左右，再覆土，每盆裝培養土1 kg，然后在表面播入已表面消毒的三葉草種子30粒，成苗后定苗25株，宿主植物種植密度為10株/dm2。為了保溫、保濕并減少被雜菌污染和病原菌侵染的機會，在盆缽上罩上透明白色的保鮮袋。在以后的培養期內，每隔10 d補充10 mL的Hoagland營養液，3個月后檢測孢子數量。

1.3.6 收獲、取樣檢測。2015年6月30日，收獲三葉草培養基質，晾干后，各取10 g用濕篩傾斜法分離介質中的孢子，體視顯微鏡下計數。

2 結果與分析

由表1可知，在培養基質、宿主植物種類、宿主種植密度（10株/dm2）以及培養條件相同的情況下，單孢接種、4孢接種和20孢接種的孢子產量有顯著差異，以20孢接種的處理孢子產量最大。因此，為獲得較高的繁殖體產量，以接種較高的繁殖體數量為宜。但是，從統計結果看，4孢和20孢接種的孢子產量并不是單孢接種的孢子產量的對應倍數，相比之下，單孢接種者繁殖系數最高（4 200）、效益最好，4孢接種中等（1 562），20孢接種最低（365），接種體孢子的數量與繁殖系數成負相關（圖1）。同時，單孢擴繁者的后代遺傳性質較為一致，能夠滿足更高的科學研究和遺傳育種需要。endprint

3 結論與討論

宿主種植密度為10株/dm2且其他培養條件相同時，地球囊霉多孢繁殖可獲得較多的再生孢子數量，單孢繁殖則能獲得更高的繁殖系數。本文在Fracchiaa等的方法基礎上略加改良，進行地球囊霉的單孢、4孢和20孢萌發接種三葉草擴繁試驗，最終都獲得了再生孢子，表明地球囊霉是可以進行單孢活體盆栽擴繁培養的。這為G. geospora Gerdemann的純系培養提供了一個簡易可行的途徑，適于科研上需要的少量接種物的培養，或應用于經過多代的Ri T-DNA轉型根[6]培養后AM真菌遺傳穩定性的恢復，從而防止AM真菌侵染率的下降。目前，菌根真菌尚不能進行純培養，菌劑培養周期長、擴繁效率低，限制了菌根在實際生產中的推廣。該試驗結果表明，在相同的培養條件下，單孢接種繁殖系數高。單孢培養純度高、遺傳變異小，可滿足科學研究上的少量使用；多孢培養產量高，可在一定程度上滿足生產使用。

4 參考文獻

[1] VAN DER HEIJDEN M G A，KLIRONOMOS J N，URIC M，et al.Mycorrhizal fungal diversity determines plant biodiversity，ecosystem variability and productivity[J].Nature，1998，396：69-72.

[2] 陳敏，王和勇，廖志華，等.發根農桿菌介導的藥用植物遺傳轉化研究進展[J].天然產物研究與開發，2000，12（3）：98-102.

[3] 郭良棟.內生真菌研究進展[J].菌物系統，2001，20（1）：148-152.

[4] DANIELS B A，SKIPER H D.Methods and principles of mycorrhizal research[M].St. Paul，Minn.：American Phytopathological Society，1982：29-35.

[5] 董昌金，鄭世學，鄭斌，等.球囊霉屬幾種AM真菌孢子表面消毒與萌發的研究[J].菌物系統，2003，22（3）：410-416.

[6] 劉琴，吳震，翁忙玲，等.發根農桿菌Ri質粒及其在植物科學中的應用[J].生物技術通報，2002（5）：21-25.endprint