杜泊綿羊胚胎移植研究

朝格吉樂圖

胚胎移植技術是生物工程領域一項高新技術，該項技術可以最大限度地發揮純種優秀母畜的繁殖潛力，大大加快良種畜群的繁育速度。為了充分發揮利用從進口杜泊綿羊的優秀遺傳基因，解決進口種羊難問題。2016年9月～ 2017 年3月在內蒙古巴彥淖爾市烏拉特前旗，對進口杜泊綿羊進行胚胎移植工作，取得了良好效果。表明將胚胎移植技術應用于大規模畜牧生產進入商品化推廣階段是可行的。主要包括：總結、驗證應用胚胎移植技術生產杜泊綿羊的最佳時間；研究供體羊同期發情、超數排卵所用激素的合適計量；應用、掌握綿羊子宮角輸精的方法，增強超數排卵的效果。

1 研究材料與方法

1.1 實驗動物與材料

1.1.1 實驗動物：選擇健康狀況良好、膘情適中、正常發情的進口杜泊母羊7只為供體；選擇12月齡以上、體格較大、發情正常、膘情適中、母性好、無生殖器官疾病的小尾寒羊100只作受體。

1.1.2 藥品：PGF2α（氯前列烯醇）， 丹東生產，.2mL：0.2mg/支；FSH（垂體促濾泡素），凍干粉末，加拿大生產，100 u/瓶；PMSG（注射用血促性素）寧波生產，1000單位/瓶；CIDR（陰道栓），新西。

1.1.3 器械：手術器械3套（手術刀、剪刀、組織鑷、止血鉗、縫合針、持針鉗、手術推車、手術燈、保定架等），生物顯微鏡，體視顯微鏡， 電刺激采精儀，水浴鍋，恒溫箱， ，開膣器，滅菌鍋，放栓槍、集精杯、耗材（注射器、醫用紗布、脫脂棉、一次性手術帽、一次性手術口罩、一次性乳膠手套、一次性平皿、一次性輸液器、噴漆等）。

2 試驗方法

2.1 地點：內蒙古巴彥淖爾市烏拉特前旗。

2.2 時間：2016年9月9日-2016年10月15日。

2.3 供、受體羊的選擇：以杜泊綿羊為供體，選擇的標準為健康無病、膘情適中、生殖器官發育良好、發情正常。小尾寒羊為受體，要求12月齡以上、體格較大、發情正常、膘情適中、母性好、無生殖器官疾病，且堅決不能接觸公畜。

2.4 供、受體羊的飼養管理：在試驗開始前60d組織人員將供、受體羊只單獨組群，并加強對供體飼養管理，每只羊每天在自然放牧的基礎上飼喂TMR顆粒飼料1 kg，以保證其營養供給。供、受體羊群圈舍需遠離公羊舍，以免公羊進入配種。

2.5 公羊的飼養管理：配種前1個月開始調整公羊日糧，將精料中的蛋白質含量提高，并且保證每天每只羊各飼喂1個胡蘿卜和1個雞蛋，配種前2周開始用電刺激采精法對公羊進行采精訓練，排出死精，準備配種。

2.6 供體母羊的超數排卵：采用FSH遞減法，1批處理，用孕酮陰道海綿栓處理10 d，開始注射FSH，每日間隔12 h，連續3 d。注射FSH的第1針時同時注射PMSG， 注射FSH的第5針時同時注射PG。注射最后一針時撤去CIDR。

2.7 供體母羊的發情鑒定和配種：要經過早、晚兩次試情，并記錄記錄母羊的發情時間。將供體母羊與帶有試情布的公羊放于同一面積適當的圈舍，觀察試情公羊及供體母羊，當母羊站立不動接受試情公羊爬跨時，肌肉注射LH1mL/只，然后開始用腹腔鏡輸精的方式進行配種，并記錄配種時間和公母羊號，每次輸原精0.2 mL以上，要求精子活力達到0.3以上。

2.8 受體羊的同期發情處理：采用PGF注射法，試劑用量每次1mL/只，間隔9～10 d再注射一次PGF ，12 h后開始用公羊試情，并標記發情羊只，要準確記錄發情的時間。

2.9 胚胎的采集、檢查和鑒定：供體羊母羊子宮角配種后7d開始收集胚胎。供體羊手術前需空腹24h，將其綁縛于手術架后對手術部位剪毛消毒，麻醉，開始手術。在乳房前2 cm腹中線兩側切口，長度為2～3 cm。將食指和中指伸入腹腔內引出子宮角和輸卵管。用18#～20#針頭在子宮角基部扎一小孔，將Fr 8-10沖卵管導入子宮角內給沖卵管氣囊充氣2～5mL，拔出沖卵管內芯，然后在宮管結合部將6#～8#針頭導入子宮角內，用40mL注射器抽取沖卵液與頭皮針連接進行子宮沖胚?；厥找河忙?20 mm表面皿接收。供體母羊創口采用兩層縫合法，即腹膜與肌肉進行連續縫合，皮膚進行結節縫合?？p合皮膚前給皮下撒適量的青霉素，并肌注青霉素。注意：在整個手術沖胚移植過程中，不暴露卵巢，只是將輸卵管和傘部輕輕地導出，同時輕輕向上提，即可檢查左右側黃體情況。

胚胎收集以后放在顯微鏡下進行胚胎等級鑒定。A級胚胎形態完整，輪廓清晰，呈球形，分裂球大小均勻，結構緊湊，色調透明度良好，無附著的細胞和液泡或很少；B級輪廓清晰，色調和細胞密度良好，可見到一些附著的細胞和液泡，變性細胞占10%～30%；C級輪廓不清晰，色調發暗，結構松散，游離的細胞或液泡較多，變性細胞超過30%，但仍有一團細胞存活；D級胚胎變性細胞占75%左右，無組織結構。其中A、B、C等級的胚胎可用于移植，D級不可用。確定胚胎可用后，把胚胎移入含有新鮮PBS的小檢卵杯中準備短期內移植。

2.10 胚胎移植：與供體羊相同，受體羊手術前需空腹24h，將其綁縛于手術架后對手術部位剪毛消毒，麻醉，開始手術。將受體羊腹腔切開一個2～3cm的小口子，食指和中指伸入腹腔，引出子宮角，并用手感覺黃體，發現有黃體后給該側子宮角移植胚胎， 子宮角兩側如都有黃體的可在兩側同時移植，兩側都無黃體的不移植，縫合創口即可。縫合皮膚前需要撒適量的青霉素，術后需要給每只羊肌注一定量的青霉素。

2.11 術后處理：手術兩天后要密切觀察供、受體羊的狀態，防止意外不良情況的產生。術后7 d供體羊需注射PG用以消除黃體。并繼續觀察受體羊的發情狀況，對第2情期后未返情的受體羊需要加強飼養管理，防止流產；對返情羊需從受體羊群中分離，并對其繼續配種。

3 研究結果

3.1 供體羊人工授精及胚胎獲得結果

腹腔鏡輸精技術是家畜品種改良工作中的一項新的繁育技術，在肉羊胚胎移植技術使用過程中，雖使用技術較為復雜，但與經陰道進入子宮頸輸精相比具有受胎率高的顯著特點，因而在目前胚胎移植技術中被廣泛使用。本次研究采用腹腔鏡輸精技術使7只供體杜泊母羊全部受孕，并成功獲得胚胎。7只供體共獲得胚胎58枚，胚胎合格率為86%。

3.2 受體羊同期發情效果

同期發情技術就是利用激素制劑調整母畜的發情周期，使其在相對集中的時間內發情。利用該技術可將受體羊的發情調整到一定時間內同時進行，使供、受體羊的發情時間同步，為胚胎移植到受體后繼續發育創造必要的條件。本研究共用同期發情方法處理100只受體母羊，其中88只表現發情，發情率為88%。

3.3 受體羊妊娠及產羔結果

在接受胚胎移植的49只受體中，有35只受體被確認為妊娠，妊娠率為71.4%，產下黑頭杜泊羔羊35只。

4 杜泊綿羊胚胎移植研究討論

4.1 杜泊綿羊胚胎移植效益

以杜泊綿羊作供體，小尾寒羊做受體，利用胚胎移植技術，可充分發掘杜泊綿羊種羊的繁殖力潛力，在不影響供、受體母羊以后繁殖性能的前提下，每只母羊每年可多產4只純種羊，比自然繁殖率提高了3倍以上，每只杜泊種羊可多創造2萬元的經濟效益。

4.2 胚胎移植技術效果分析

4.2.1 胚胎移植時間合適

本次試驗研究選取在文獻介紹胚胎移植成功率較高的秋季進行，小尾寒羊母羊受體的妊娠率達到71.4%，與吳曉東等用小尾寒羊移植杜泊供體試驗妊娠率的53.8%結果高出32.7%，高與昭通綿羊秋季試驗妊娠率68.6%結果。表明小尾寒羊在秋季移植的妊娠率要高于春季。

4.2.2 注重對受、供體母羊及公羊管理

對供體母羊科學管理的程度決定了提供胚胎的質量，而受體母羊的管理水平則關系到胚胎移植后妊娠率的高低，因此胚胎移植前期對供、受體母羊及其公羊進行了精心的飼養管理。胚胎移植手術完成以后，及時的對受體羊返情情況進行了認真細致的觀察，并將妊娠成功的母羊單獨組群，并進行精細管理，在妊娠后期加強了補飼，臨產前加強管理，對難產嗎、母羊予以人工輔助生產，從而保證了較高的產羔成活率；種公羊在注重營養保證精子質量的同時，要適時進行采精訓練，使其性欲和精液品質在配種時達到最佳。

4.2.3 其他說明

本次試驗采用內窺鏡輸精法對供體種羊進行輸精，這種方法與陰道輸精法相比受胎率顯著的增加，從而保證了超數排卵的數量較高與質量較好。

作者單位：內蒙古巴彥淖爾市家畜改良工作站