3種秸稈腐熟劑微生物組成及其腐熟效果

孫 旭， 汝超杰， 蘇良湖， 陳玉東， 趙克強， 張龍江， 蔡金傍

(1.南京大學生命科學學院，江蘇南京 210023； 2.環境保護部南京環境科學研究所，江蘇南京 210042； 3.河海大學環境學院，江蘇南京 210098)

通信作者：蔡金傍，博士，副研究員，從事農村環境污染防治研究。E-mail：jinbangcai@126.com。

我國農作物秸稈的年產量在7億t左右，利用率僅為78%，約2億t秸稈隨意堆放在田間地頭或焚燒，造成了巨大的資源浪費和環境污染[1]。秸稈腐熟劑可加速秸稈中有機物的降解，發酵的有機肥施入農田中可增加土壤有機質含量，提高農作物抵御病害能力，加快農作物秸稈的資源化利用，減少秸稈焚燒帶來的環境污染[2-3]。目前，我國生產秸稈腐熟劑的企業約有130余家，登記的腐熟劑產品有40個左右，而作為腐熟劑的菌種則達40種，涵蓋細菌、真菌和放線菌[4]。經農業部土壤有機質提升補貼項目的實施，秸稈腐熟劑已有大量的應用，但存在腐熟劑種類多、菌種數量不足、菌種穩定性差、堆肥效果不理想的問題，不利于秸稈腐熟劑的推廣與應用。以前對秸稈腐熟劑的研究大多集中在菌種篩選及腐熟性能方面，而對菌種組成與腐熟效果之間關系的研究較少[5-7]。針對秸稈腐熟劑在使用過程中存在的問題，本研究以3種秸稈腐熟菌劑為研究對象，考察秸稈腐熟菌劑的菌種組成以及對玉米秸稈的腐熟效果，為秸稈腐熟菌種篩選以及腐熟劑的推廣提供理論基礎和技術指導，具有一定的理論和應用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米秸稈和牛糞分別由南京六合勤豐秸稈有限公司和江蘇鎮江三明生物有限公司提供，基本性質見表1。秸稈腐熟劑為康源綠洲有機肥發酵菌劑、宜春堆肥腐熟劑、南華千牧EM菌劑，3種秸稈腐熟劑均為粉末狀固體。

1.2 腐熟劑微生物組成分析

表1 玉米秸稈和牛糞的基本特性

秸稈腐熟劑微生物數量采用平板稀釋法測定[8]。腐熟劑微生物組成采用高通量測序技術進行分析，按照Fast DNA試劑盒的操作說明提取腐熟劑基因組DNA，用引物338F/806R和817F/1 196R分別對細菌和真菌16S/18S rDNA基因進行PCR擴增[9]。將PCR產物純化后送上海美吉公司進行Illumina Miseq測序，分別獲得細菌、真菌16S/18S rDNA基因58 483、53 391條原始序列，去掉長度小于300 bp、含模糊堿基和引物堿基2個以上錯配、單堿基重復超過6個的低質量序列后分別得到34 512、25 393條高質量序列，將獲得的序列上傳至核糖體數據庫項目分類器[(RDP，ribosomal database project) classifier]，得到細菌和真菌的分類信息。本研究中Illumina Miseq測序獲得的序列在NCBI Sequence Read Archive(SRA)上的登錄號為SRX2010874。

1.3 堆肥試驗

2015年8月4—30日在環保部南京環境科學研究所，將18.0 kg玉米秸稈和2.0 kg牛糞混勻，調節含水率為70%，C/N 約為29，平均分裝到4個73 cm×53 cm×44 cm的180 L塑料整理箱中，設置1個對照(CK)和3個秸稈腐熟劑處理組，各腐熟劑分別以0.2%的量接入堆體進行25 d的秸稈腐熟試驗，于腐熟后0、5、10、15、20、25 d取發酵物于-20 ℃下保存。

每天14：00用溫度計監測堆體四周及中間區域30 cm深處的溫度，取平均值作為堆體溫度；取3 g堆肥樣品，按照 1 ∶10 加入蒸餾水，充分振蕩、離心后測定上清液pH值；將烘干至恒質量的樣品在600 ℃馬弗爐中灼燒3 h后稱質量，計算揮發性固體物(VS)含量；采用CHN-O-Rapid元素分析儀測定堆肥樣品的C/N；種子發芽指數(GI)參考竹江良的方法[10]進行測定。

1.4 數據分析

試驗結果以“平均值±標準差”表示，采用SPSS 18.0軟件進行數據方差分析(One-way ANOVA)檢驗處理間差異顯著性，用Duncan’s法進行多重比較(P<0.05水平差異顯著，P>0.05水平差異不顯著)。

2 結果與分析

2.1 腐熟劑微生物組成

2.1.1 腐熟劑微生物數量 3種秸稈腐熟劑中活菌數為 3.33×1010～19.13×1010CFU/g(表2)，符合GB 20287—2006《農用微生物菌劑》的標準，細菌是優勢微生物，約占活菌總數的 99.9%，南華腐熟劑中細菌數量可達19.13×1010CFU/g，分別是康源和宜春腐熟劑細菌數量的5.74、4.00倍。腐熟劑中真菌和放線菌數量占活菌總數的0.1%不到，其中康源腐熟劑真菌數量最多，宜春腐熟劑放線菌數量最多，而南華腐熟劑中真菌和放線菌數量最少(表2)。

表2 3種秸稈腐熟劑微生物數量

注：n=3；同列數據后不同的字母表示在0.05水平上差異顯著。

2.1.2 腐熟劑微生物組成 為了解腐熟劑中微生物組成，采用高通量測序方法對腐熟劑中細菌和真菌種類進行分析，在97%相似度水平下分別將細菌、真菌序列統一測序深度至 8 000、6 000，細菌和真菌的分類信息如表3所示，3種秸稈腐熟劑中細菌和真菌種類存在明顯差異，細菌序列可分為13門28綱54屬，主要分布在厚壁菌門芽孢桿菌綱，相對豐度為90.5%～96.4%。康源腐熟劑主要以腸球菌(Enterococcus)為主，與屎腸球菌(Enterococcusfaecium)相似度達到99%；宜春腐熟劑則以芽孢桿菌(Bacillus)和側孢芽孢桿菌(Brevibacillus)為主，南華腐熟劑以魏斯式菌(Weissella)和芽孢桿菌為主。真菌序列主要是子囊菌門酵母菌綱酵母菌(Saccharomyces)，與釀酒酵母(S.servazzii)相似度達到100%，相對豐度在80.62%～99.76%。

表3 3種腐熟劑微生物組成

2.2 腐熟劑腐熟效果

2.2.1 腐熟過程中的溫度變化 溫度是玉米秸稈腐熟程度的一個重要表征參數，不同腐熟劑對玉米秸稈腐熟溫度的影響如圖1所示，添加腐熟劑有助于提高玉米秸稈腐熟的最高溫度以及延長高溫階段(>45 ℃)持續時間。不加腐熟劑的玉米秸稈最高腐熟溫度為42 ℃，并未進入高溫腐熟階段。而添加康源、宜春、南華腐熟劑后，玉米秸稈的最高腐熟溫度分別達到51、45、56 ℃，高溫腐熟階段分別維持在5、1、5 d。堆體溫度在50 ℃以上保持5～7 d，是保證堆肥達到衛生學指標和腐熟的必要條件，添加康源和南華腐熟劑的堆肥均能滿足堆肥衛生指標的要求，其中南華腐熟劑對玉米秸稈的高溫降解更徹底。

2.2.2 腐熟過程中pH值的變化 pH值是影響微生物活性的主要因子之一。如圖2所示，玉米秸稈腐熟過程中pH值呈現逐漸上升的趨勢，腐熟初期上升最快，添加康源和南華腐熟劑的玉米秸稈pH值高于對照的pH值，而添加宜春腐熟劑的玉米秸稈pH值低于對照的pH值，可能是由于接種康源和南華腐熟劑加速了玉米秸稈的礦化，產生大量的NH3，從而導致pH值的增加。到25 d時各處理組的pH值在8.4～8.8之間，符合堆肥腐熟pH值在8.0～9.0的要求。

2.2.3 腐熟過程中揮發性固體物含量的變化 腐熟過程中揮發性固體物質的變化可以反映玉米秸稈中有機質的降解情況，結果如圖3所示。添加腐熟劑處理堆肥的VS含量均低于對照處理，表明3種腐熟劑均能促進玉米秸稈有機質的降解。其中，康源和南華腐熟劑對玉米秸稈的降解效果較好，經過25 d的腐熟，VS含量分別減少到69.45%和69.14%。

2.2.4 腐熟過程中C/N的變化 玉米秸稈腐熟過程中C/N的變化如圖4所示，添加腐熟劑處理組的C/N在腐熟后5 d已降至20以下，而對照組則需要15 d的時間；經25 d腐熟后，4個處理組C/N在13.43～14.22之間，且已完全腐熟。表明3種腐熟劑均能促進玉米秸稈腐熟，縮短達到腐熟的時間，3種腐熟劑對玉米秸稈腐熟過程中C/N沒有明顯影響。

2.2.5 腐熟過程中GI的變化 種子發芽指數(GI)常被用來測定堆肥的生物毒性，是表征堆肥腐熟水平的重要生物學指標之一。不同處理組的GI值呈先下降后上升的趨勢(圖5)，在腐熟后5 d時4個處理組GI值均低于70%，添加腐熟劑組GI值均低于對照組，這可能是由于接種腐熟劑后加快有機質的降解，產生了較多的有毒物質(氨和低級脂肪酸等)，抑制了水堇種子的發芽。在腐熟后15 d時添加腐熟劑組GI值均大于80%，而對照組GI值在腐熟后20 d才達到80%，經過25 d腐熟，4個處理組的GI值由高到低的順序為南華>康源>宜春>對照，表明添加腐熟劑有助于降低秸稈腐熟發酵物植物毒性，加快堆肥腐熟進程。

3 討論

秸稈腐熟劑的菌種組成通常決定了腐熟劑的腐熟效果，因此本研究隨機選取3種秸稈腐熟菌劑，考察其菌種組成以及對玉米秸稈的腐熟效果。以前對秸稈腐熟劑成品的研究主要集中在腐熟特征及腐熟劑篩選上，而對菌種組成與腐熟效果之間關系的研究較少，尤其是采用高通量測序方法研究腐熟劑菌種組成還鮮有涉及[5-7，11-12]。本研究通過平板計數及焦磷酸測序得到的細菌(13門和54屬)和真菌(1門和1屬)分類結果顯示，3種腐熟劑均由多種微生物菌種復合而成，以細菌為主、真菌和放線菌為輔，細菌的種類多于真菌，腐熟劑中有效活菌數量達到5.5×1010～19.1×1010CFU/g，與前人的研究結果[13]一致。與克隆文庫相比，高通量測序方法能反映腐熟劑中更多的微生物信息，本研究中康源腐熟劑中腸球菌序列與屎腸球菌相似度達到99%，屎腸球菌雖然是一種發酵能力較強的菌株，但也是一種條件致病菌，存在潛在環境風險[12，14-15]。宜春和南華腐熟劑中細菌主要是芽孢桿菌、側孢芽孢桿菌、魏斯式菌，這些菌株對玉米和水稻秸稈具有很強的降解能力[16-17]。3種腐熟劑中真菌種類較為單一，以釀酒酵母為主，其常作為廚余垃圾堆肥初期的接種菌劑，有助于加速堆肥的進行[18]。

為了驗證3種腐熟劑對玉米秸稈的腐熟效果進行 25 d 的腐熟試驗，結果表明，3種腐熟劑均能促進玉米秸稈腐熟升溫，延長高溫階段持續時間，降低揮發性固體物質和C/N，減少腐熟物的植物毒性，縮短腐熟時間，加快腐熟進程。大量的研究表明，在自然堆肥初期接種微生物菌劑能增加堆肥初期微生物數量，提高微生物代謝活性，加快有機物的降解，促進堆料的腐熟，例如在堆肥初期接種芽孢桿菌和鏈霉菌，可在堆肥過程中增加細菌數量，加速有機質分解[19]；接種EM菌劑有利于堆肥礦化作用，縮短堆肥腐熟時間5～8 d[20]。但也有學者認為，接種的外源微生物在與土著微生物競爭過程中處于劣勢，難以形成優勢菌，所以沒有必要接種微生物菌劑[21]。

3種腐熟劑以南華腐熟劑對玉米秸稈的腐熟效果最好，接種南華腐熟劑處理組升溫最快，高溫維持時間最長，VS含量降低得最多，GI值最高，這可能與接種腐熟劑的有效活菌數量和種類有關。在同等接種量下，南華腐熟劑中有效活菌數量可達19.13×1010CFU/g，分別是康源和宜春腐熟劑細菌數量的5.74、4.00倍左右，可以增加腐熟初期微生物數量。南華腐熟劑中細菌主要是芽孢桿菌和魏斯式菌，真菌以酵母菌為主，這類微生物是常用的秸稈腐熟菌種，能產生纖維素酶、半纖維素酶類、葡聚糖酶等多種消化酶，對纖維素類的秸稈具有較強的降解能力，在有機肥制備、廚余垃圾處理以及環境凈化方面有廣泛的應用[22-23]。

4 結論

本研究表明，接種腐熟劑有助于促進玉米秸稈的腐熟，由于不同的腐熟劑中微生物種類不同，對堆肥腐熟程度的影響存在差異，為接種的微生物菌劑提供菌種資源，主要結論如下：(1)3種秸稈腐熟劑均為細菌、真菌、放線菌復合而成的微生物菌劑，有效活菌數由高到低依次為南華>宜春>康源，細菌是優勢微生物；(2)3種腐熟劑真菌以釀酒酵母為主，細菌組成存在明顯差異，康源腐熟劑中細菌主要是腸球菌，宜春腐熟劑中細菌以芽孢桿菌和側孢芽孢桿菌為主，南華腐熟劑則以魏斯式菌和芽孢桿菌為主，康源腐熟劑存在潛在的環境風險；(3)3種腐熟劑均能促進玉米秸稈腐熟，縮短腐熟時間，達到無害化標準，其中南華腐熟劑更有利于玉米秸稈的分解，腐熟效果更好。

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