抗真菌活性化合物篩選及保鮮效果初步評價

林群英， 吳亮亮， 吳素玲， 石寶俊，2， 朱海亮， 張衛(wèi)明

(1.中華全國供銷總社南京野生植物綜合利用研究院，江蘇南京 210042； 2.億利耐雀生物科技有限公司，江蘇南京 210038； 3.南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210093)

通信作者：石寶俊，博士，副研究員，主要從事植物化學(xué)成分研究。E-mail：jacksonshi@126.com。

食用菌營養(yǎng)價值高，富含蛋白和膳食纖維，且低脂肪，深受市場歡迎。隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，其產(chǎn)量已經(jīng)占全球80%以上。因食用菌大部分以鮮品形式進(jìn)行流通，水分含量高，同時，工廠化生產(chǎn)具有強(qiáng)烈的地域性而農(nóng)戶生產(chǎn)則具有明顯的季節(jié)性，造成的腐爛損耗量大。目前控制食用菌采后保鮮的最有效手段是冷藏處理[1-3]和氣調(diào)措施[4]。由于冷藏保鮮需特定設(shè)備且成本高等因素，生產(chǎn)應(yīng)用中受到限制。為滿足食用菌保鮮的需求，開發(fā)合適的保鮮技術(shù)，是促進(jìn)食用菌產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑。保鮮劑是果蔬保鮮常用的保鮮技術(shù)，可有效抑制病原微生物，延長保鮮期[5-6]。目前食用菌保鮮劑多針對生理變化和細(xì)菌性病變進(jìn)行研究，對抑制病原真菌的保鮮劑研究較少。亞硫酸鈉、殼聚糖、L-半胱氨酸及CaCl2等已被用于銀耳和金針菇保鮮研究，取得一定的效果[7-8]。本研究對60種化合物抗病原真菌活性進(jìn)行測定，利用平板試驗測定各化合物對產(chǎn)黑曲霉、黃青霉、雜色曲霉、綠色木霉和木霉等5種病原真菌的抑制率，根據(jù)初篩選結(jié)果，分析效果較好的化合物對病原真菌的量效關(guān)系，并以金針菇為材料初步驗證其保鮮效果，為開發(fā)食用菌保鮮劑提供新材料。

1 材料與方法

1.1 材料

食用菌常見病原真菌：黑曲霉(Aspergillusniger)、產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)、雜色曲霉(A.versicolor)、綠色木霉(Trichodermaviride)、木霉(Trichodermasp.)，由中華全國供銷總社南京野生植物綜合利用研究院提供。

PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉 20 g、KH2PO41 g、MgSO40.5 g，定容至1 L，121 ℃，滅菌 20 min，趁熱制成平板培養(yǎng)基。

供篩選抑菌化合物：共60種，包括：含噻唑烷苯并二氫呋喃酮結(jié)構(gòu)化合物(編號為ZTT，共5種)、含吲哚及吡唑酰胺結(jié)構(gòu)化合物(編號為WZF，共13種)、含吲哚苯環(huán)酰胺結(jié)構(gòu)化合物(編號為mrj，共18種)、含硝基咪唑及聯(lián)苯吡唑類羧酸酯結(jié)構(gòu)化合物(編號為CLW，共24種)，由南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。各化合物以無菌水配制成0.1 mg/mL濃度。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原真菌孢子混懸液制備 各病原真菌接種于PDA培養(yǎng)基內(nèi)，28 ℃下培養(yǎng)7 d。用接種針刮取病原真菌孢子或菌絲，轉(zhuǎn)至含1%吐溫80水溶液中，充分混勻，利用血球計數(shù)板計算孢子濃度，將孢子濃度調(diào)整為2×106CFU/mL。

1.2.2 抗菌化合物對病原真菌的抑制率測定 將待測定的抑菌化合物劑溶液0.5 mL均勻涂布在PDA平板，以無菌水作為陰性對照組。經(jīng)滅菌的直徑為5 mm大小的濾紙片，加到含病原真菌孢子的混懸液內(nèi)，使其充分沾上病原菌的孢子和菌絲，于平板中央接入將帶孢子的濾紙片。20 ℃下培養(yǎng) 7 d，測定各菌落直徑大小，計算抑制率。各試驗設(shè)置3重復(fù)。以0.1%苯甲酸鈉為陽性對照。

1.2.3 量效關(guān)系分析 選取平板試驗中篩選所得的對病原菌抑制效果良好的化合物配制成梯度濃度(0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.10 mg/mL)，采取無菌水作為陰性對照組。余下操作依“1.2.2”節(jié)進(jìn)行。

1.2.4 化合物保鮮效果初步評價 選取金針菇新鮮子實體，各化合物濃度為10 mg/L，均勻噴灑至子實體表面，置于陰涼處晾干，用保鮮盒裝好，20 ℃下放置4 d，進(jìn)行水分、褐變度和可溶性還原糖測定[9]。所有試驗于2017年1—7月在中華全國供銷總社南京野生植物綜合利用研究院進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗真菌活性篩選

2.1.1 含噻唑烷苯并二氫呋喃酮結(jié)構(gòu)化合物抗真菌活性 與陽性對照苯甲酸鈉(圖1)相比，含噻唑烷苯并二氫呋喃酮結(jié)構(gòu)化合物(ZTT系列)中，除ZTT-2-32外，ZTT-2-31、ZTT-2-34、ZTT-2-41、ZTT-2-43均對黑曲霉有較好的抑制作用，其中ZTT-2-31和ZTT-2-43的抑制率均達(dá)19.23%(圖2)。ZTT-2-41對雜色曲霉的抑制率為 16.88%。ZTT-2-32和ZTT-2-34對綠色木霉的抑制率分別為16.83%和15.58%。此系列化合物對產(chǎn)黃青霉的抑制率均低于10%。除ZTT-2-32外，其他化合物對木霉的抑制率亦低于10%，而陽性對照苯甲酸鈉對木霉未顯示出任何的抑制。由此可見，化合物ZTT-2-32和ZTT-2-43對5種病原真菌的抑制效果較好。

2.1.2 含吲哚及吡唑酰胺結(jié)構(gòu)化合物抗真菌活性 含吲哚及吡唑酰胺結(jié)構(gòu)化合物(WZF系列)中，WZF-39對黑曲霉的抑制率最高，達(dá)22.76%，其次是WZF-32，抑制率為19.51%，WZF-28、WZF-33、WZF-46和WZF-49對黑曲霉的抑制率均在10%以上(圖3)。WZF-28、WZF-34和WZF-41對產(chǎn)黃青霉的抑制率均為16.48%。對雜色曲霉的抑制率在20%以上的化合物共有11個，其中以WZF-32最高，達(dá)32%。此系列的化合物對綠色木霉和木霉的抑制率偏低，大部分均低于10%。由此可見，WZF-39對5種病原真菌的抑制效果最好，其次是WZF-32。

2.1.3 含吲哚苯環(huán)酰胺結(jié)構(gòu)化合物抗真菌活性 含吲哚苯環(huán)酰胺結(jié)構(gòu)化合物(mrj系列)中僅mrj-87對黑曲霉的抑制率達(dá)10%以上，其余化合物均低于10%。mrj-87對產(chǎn)黃青霉的抑制率最高，為21.5%，其次是mrj-80和mrj-90。mrj-67 對雜色曲霉的抑制率最高，為21.89%，mrj-49和mrj-54對綠色木霉的抑制率均在20%以上，而mrj-70、mrj-86 和mrj-90對木霉的抑制率在20%以上，其中 mrj-90 的抑制率高達(dá)28.16%(圖4)。結(jié)合對5種病原真菌的抑制率，mrj-70對單一病原真菌的抑制雖不突出，但其對5種病原真菌的抑制卻最為全面。由此可推斷，mrj-70和mrj-87是此系列抗真菌活性較好的化合物。

2.1.4 含硝基咪唑及聯(lián)苯吡唑類羧酸酯化合物抗真菌活性 含硝基咪唑及聯(lián)苯吡唑類羧酸酯化合物(CLW系列)對5種病原真菌的抑制效果較其他系列差，對黑曲霉的抑制率最高的是CLW-143，僅為11%(圖5)。CLW-115對產(chǎn)黃青霉的抑制率最高，為16.24%，其次為CLW-120，抑制率為 14.79%，大部分化合物的抑制率在10%以下。CLW-140對雜色曲霉的抑制率為18.91%，大部分化合物的抑制率在10%以下。CLW-137對綠色木霉的抑制率最高，達(dá)24.4%，其次是CLW-115，為22.04%。另有12個化合物的抑制率在10%以上，其他的則低于10%。此系列化合物對木霉的抑制率不高，CLW-120為最高，抑制率為15.01%。

2.2 量效關(guān)系分析

化合物ZTT-2-32和ZTT-2-43對黑曲霉的抑制效果存在明顯的量效關(guān)系，隨著濃度的增大，抑菌率亦隨之提高(圖6)。化合物WZF-39和mrj87對產(chǎn)黃青霉抑制效果同樣存在明顯的量效關(guān)系(圖7)。這4種化合物的結(jié)構(gòu)式見圖8。

2.3 化合物保鮮效果的初步評價

化合物WZF-39對金針菇的失質(zhì)量率和褐變度有明顯的抑制作用，失質(zhì)量率和褐變率分別為4.73%和0.18(圖9)。其次是ZTT-2-43和mrj-87，金針菇的失質(zhì)量率和褐變度分別為5.07%、0.22和4.87%、0.25，明顯低于空白對照組。這說明化合物對金針菇具有一定的保鮮效果。

3 討論

通過對60種化合物對食用菌病原菌抑制率的測定、量效關(guān)系分析以及初步的保鮮效果評價，獲得4種抗病原真菌效果較好的化合物，分別是含噻唑烷苯并二氫呋喃酮結(jié)構(gòu)化合物2種(編號：ZTT-2-32和ZTT-2-43)、含吲哚及吡唑酰胺結(jié)構(gòu)化合物(編號：WZF-39)、含吲哚苯環(huán)酰胺結(jié)構(gòu)化合物(編號：mrj-87)。吡唑酰胺類化合物具有殺蟲和抗菌等多種生物活性等方面有報道[10-11]，本研究篩選獲得的 WZF-39 和mrj-87這2種化合物的抗真菌活性與前人報道相似。食用菌采后存貯和流通過程中，病原真菌是導(dǎo)致腐爛的重要生物因素，而這些病原真菌可能源于生產(chǎn)過程[12-13]，本研究針對病原真菌進(jìn)行保鮮劑篩選開發(fā)，并獲得4種抑制率較好的化合物，為開發(fā)食用菌專用型保鮮劑提供了良好的原料。這些化合物以天然化合物為基礎(chǔ)，進(jìn)行一定的結(jié)構(gòu)修飾而成。這種方法解決了天然產(chǎn)物的提取工藝復(fù)雜，成本高，而且資源消耗非常大的問題[14]，為篩選出高效的綠色防腐保鮮劑提供了快捷有效的途徑，為實現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要的技術(shù)支撐。

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