防治番茄土傳病害拮抗微生物的篩選與應用效果

王志春， 孫星星

(1.江蘇省鹽城市新洋農業(yè)試驗站，江蘇鹽城 224049； 2.江蘇沿海地區(qū)農業(yè)科學研究所，江蘇鹽城 224002)

通信作者：孫星星，碩士，助理研究員，主要從事天敵生態(tài)防治以及植物保護研究。E-mail：13921865625@ 163.com。

植物土傳病害[1-2]是發(fā)生在植物根部或莖部以土壤為媒介進行傳播的病害的統(tǒng)稱，包括根腐病、枯萎病、猝倒病、立枯病、疫病、黃萎病等。土傳病害已經成為嚴重制約我國設施果蔬業(yè)發(fā)展的主要因素，這類病害的病原物生活史一部分或大部分存在于土壤中，在條件適宜時病原物萌發(fā)并侵染植物根部或莖部導致植物發(fā)生病害。

江蘇省沿海地區(qū)設施蔬菜種植面積大，其中以茄果類、葉菜類種植為主，由于種植高度集約化、復種指數(shù)高、品種單一等原因給土傳病害病原菌提供了賴以生存的場所，造成土傳病害發(fā)生不斷加重。造成土傳病害的主要原因通常有3個方面[3]。首先是作物連作，相應的病原菌得以連續(xù)繁殖，在土壤中大量積累，形成病土，茄科蔬菜連作，疫病、枯萎病等發(fā)生較嚴重；其次是施肥不當，偏施氮肥可以刺激土傳病害病原菌中的鐮刀菌、輪枝菌和絲核菌生長，從而加重土傳病害的發(fā)生；再次是線蟲侵害，土壤中的線蟲侵害根系，可以造成傷口，有利于病原菌侵染，線蟲與真菌性病害往往同時發(fā)生，如棉花枯萎病與土壤線蟲密不可分，在美國棉花枯萎病被稱為“枯萎-線蟲”復合病害。

本研究以江蘇省沿海地區(qū)番茄枯萎病與根腐病為例，篩選對設施土壤中常見病原菌具有較強抑制作用的拮抗微生物，并研究它與農業(yè)廢棄物的混用配方，以期減少化學農藥的使用，保護土壤并實現(xiàn)農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

盆栽基質：醬渣，由江蘇省鹽城市光明醬油廠提供；草炭、蛭石，均為市售。供試作物：番茄品種為金鵬1號，購自西安金鵬種苗有限公司。

PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，15～20 g瓊脂，1 000 mL 超純水。NA培養(yǎng)基：10.0 g蛋白胨，3.0 g牛肉粉，5.0 g氯化鈉，15.0 g瓊脂，pH值為7.3±0.1。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗菌株的分離 于江蘇省鹽城市射陽縣(SY)、亭湖區(qū)(TH)、鹽都區(qū)(YD) 采集發(fā)生番茄土傳病害的土壤，采用稀釋法分離細菌。將分離得到的產物置于PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，挑取單菌落純化。拮抗細菌的分離、純化和培養(yǎng)均在NA培養(yǎng)基中進行。

1.2.2 番茄枯萎病孢子懸浮液制備方法 將尖孢鐮刀菌番茄專化型[Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici(Sacc) Snyder et Hansen]菌株接種于固體PDA培養(yǎng)基平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌絲長滿培養(yǎng)基表面后用打孔器將其制成直徑為6 mm的菌塊。將菌塊接種于250 mL裝有液體PDA培養(yǎng)基的三角瓶中，而后置于28 ℃、120 r/min的搖床中培養(yǎng)，待培養(yǎng)基懸液長出明顯菌絲并變?yōu)樯罴t色時，將培養(yǎng)基懸浮液用滅菌紗布過濾，收集病原菌孢子懸浮液。孢子懸浮液用無菌水重懸后適當稀釋，用血球計數(shù)板統(tǒng)計孢子濃度，將孢子懸浮液的濃度調至1×106CFU/mL備用。番茄根腐病病菌孢子懸浮液的制備方法同上。

1.2.3 拮抗菌株篩選方法 采用抑制菌絲生長法篩選拮抗菌。用接種環(huán)挑取1環(huán)PDA培養(yǎng)基上的菌株，用無菌水稀釋107倍，取2 mL 107倍稀釋液與23 mL NA培養(yǎng)基混合倒平板。在每個平板中心接種1個6 mm的菌塊，菌塊帶菌絲一面靠在培養(yǎng)基表面，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，十字交叉法測定菌絲的直徑。每個處理重復4次，以無菌水與NA培養(yǎng)基混合作為對照。

1.2.4 拮抗菌株田間小區(qū)試驗 接種方法采用灌根并結合自然發(fā)病方法。選取室內篩選出的抑菌能力較強的菌株，每個處理4次重復，小區(qū)面積為30 m2。在番茄6～7片真葉時開始移栽，移栽時采用孢子懸浮液灌根法接種番茄枯萎病病菌和根腐病病菌。移栽10 d后，采用灌根法施用50 mL拮抗菌株107倍稀釋液，隔10 d再施用1次，以清水處理作為對照。處理10 d后調查田間發(fā)病率及防治效果。發(fā)病率=調查發(fā)病株數(shù)/調查總株數(shù)×100%；防效=[(對照區(qū)發(fā)病株數(shù)-處理區(qū)發(fā)病株數(shù))/對照區(qū)發(fā)病株數(shù)]×100%。

1.2.5 拮抗菌株與基質混合對枯萎病、根腐病的抑制試驗 本試驗共設5個處理，處理A：草炭、蛭石質量比為1 ∶1；處理B：草炭、蛭石質量比為1 ∶1+拮抗菌株稀釋液；處理C：醬渣、草炭、蛭石比為1 ∶1 ∶1+拮抗菌株稀釋液；處理D：醬渣、草炭、蛭石質量比為5 ∶1 ∶1 +拮抗菌株稀釋液；處理E：醬渣、草炭、蛭石質量比為10 ∶1 ∶1+拮抗菌株稀釋液。將上述基質按比例混合后裝入花盆中，用拮抗菌株稀釋液將基質澆透，將番茄幼苗(6～7片真葉)移入盆內，每盆1株，3 d后采用灌根法接種番茄枯萎病病菌和根腐病病菌。15 d 后檢查發(fā)病株數(shù)及防治效果。

2 結果與分析

2.1 室內抑菌能力的測定結果

從江蘇省鹽城市射陽縣(SY)、亭湖區(qū)(TH)、鹽都區(qū)(YD)發(fā)生番茄土傳病害的根際土壤中共分離到7株細菌，其中，7株菌株對番茄枯萎病病菌表現(xiàn)出抑菌活性(表1)，4株菌株對番茄根腐病病菌表現(xiàn)出抑菌活性(表2)。由表1、表2可知，YD11菌株對番茄枯萎病病菌的抑菌活性最高，抑制率高達82.4%，TH2、TH14菌株次之，抑制率分別為73.4%、72.4%。TH2菌株對番茄根腐病病菌的抑制能力最好，抑制率為76.5%，其次為YD11菌株，抑制率為73.3%。綜上所述，YD11菌株對番茄枯萎病病菌和根腐病病菌均表現(xiàn)出較好的抑制能力。

表1 7株菌株對番茄枯萎病抑菌活性測定

表2 4種菌株對番茄根腐病抑菌活性測定

2.2 拮抗菌株對番茄枯萎病、根腐病的田間防效

由表3可知，處理10 d后，YD11菌株對番茄枯萎病及根腐病的田間防效較好，分別為58.8%、52.2%；TH2菌株對番茄根腐病的防效次之，達到52.0%，但對番茄枯萎病的防效僅為39.2%；TH6菌株對番茄枯萎病的防效為47.2%，但對番茄根腐病的防效僅為37.3%。綜上所述， YD11菌株對番茄枯萎病及根腐病的防治效果較為突出。

表3 拮抗菌株對番茄枯萎病、根腐病的田間防效

注：數(shù)據后不同大寫、小寫字母分別表示與對照相比在0.01、0.05水平上差異顯著。下表同。

2.3 拮抗菌株YD11與基質混合對枯萎病和根腐病抑制試驗

通過室內篩選及田間藥效試驗確定YD11菌株對番茄枯萎病及根腐病的防治效果較好，將YD11菌株與不同基質混合后，由表4可知，基質配方中醬渣、草炭、蛭石的質量比為 5 ∶1 ∶1 時，與拮抗菌株YD11稀釋液混合對番茄枯萎病和根腐病的防治效果最好，其對番茄枯萎病的防治效果極顯著高于其他處理(P<0.01)；處理D與處理E對番茄根腐病的防治效果無顯著性差異，但極顯著高于其他(P<0.01)。不含醬渣的基質配方混合拮抗菌株稀釋液對番茄枯萎病與根腐病防治效果最差，分別僅為34.0%、21.8%。

表4 YD11拮抗菌株與基質混合對枯萎病和根腐病抑制試驗

3 結論與討論

當前設施蔬菜土傳病害的防治主要依賴化學藥劑(阿維菌素、噻唑磷等)，長期使用化學藥劑導致病株菌的抗藥性迅速上升，同時對環(huán)境造成較大的壓力。有研究表明，作物發(fā)生土傳病害的關鍵因素是土壤微生物區(qū)系的改變，即有益細菌優(yōu)勢群落嚴重降低，而引起病害的真菌群落明顯增加[4]。目前，報道對設施蔬菜造成危害的土傳病害病原菌主要有疫病病菌(Phytophthoracactorum)、根腐病病菌(Fusariumsolani)、黑斑病病菌(Alternariapanax)、菌核病病菌(Seclerotiniasp.)、軟腐歐文氏菌(Erwinniacarotovora)、立枯絲核病病菌(Rhizoctoniasolani)、腐霉病病菌 (Pythumsp.)，不同地區(qū)由于栽培管理方式之間的差異，土傳病害優(yōu)勢種群有一定的差異，江蘇省沿海地區(qū)設施蔬菜上主要以枯萎病、黃萎病、青枯病、疫病發(fā)生為主，對當?shù)厥卟似焚|與產量造成嚴重的危害[5]。據報道，對土傳病害作用顯著的微生物主要有枯草芽孢桿菌、放射形土壤桿菌、淀粉液化芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌等。

關于基質中添加農用廢棄物的報道[6-7]已有很多，包括醋糟、菌糠發(fā)酵物、雞糞、豬糞等， 但關于醬渣的報道不多，本

研究的結果為農業(yè)廢棄物的處理提供了一條新的思路，并為防治植物土傳病害提供了新的理論依據。

參考文獻：

[1]李長松. 拮抗性細菌生物防治植物土傳病害的研究進展[J]. 中國生物防治學報，1992，8(4)：168-172.

[2]黎起秦，陳永寧. 植物土傳病害拮抗真菌的篩選[J]. 西南農業(yè)學報，1999，12(3)：81-84.

[3]王玉菊，祁紅英，郭堅華. 植物土傳病害的微生物防治研究進展[J]. 世界農業(yè)，1995(1)：37-39.

[4]付 琳. 新墾香蕉園施用生物有機肥構建防控土傳枯萎病土壤微生物區(qū)系研究[D]. 南京農業(yè)大學，2016.

[5]梁雪杰. 番茄土傳病害拮抗菌的篩選，鑒定及其防病機理初探[D]. 南京：南京農業(yè)大學，2013.

[6]林 英. 醋糟基質對土傳病害的抑制效果及其拮抗微生物的研究[D]. 鎮(zhèn)江：江蘇大學，2014.

[7]周 巍. 菌糠發(fā)酵物對常見黃瓜土傳病害防治及土壤微生物群落影響[D]. 北京：北京林業(yè)大學，2012.