豬口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）新佐劑評估試驗

秦守賢 孫 濤

（1.上海交通大學農業與生物學院，上海 200240；2.申聯生物醫藥（上海）股份有限公司，上海 200241）

合成肽疫苗是一種僅含免疫決定簇組分的小肽，即用人工方法按天然蛋白質的氨基酸順序合成保護性短肽，與載體連接后加佐劑所制成的疫苗，是最為理想的安全新型疫苗，也是目前研制預防和控制感染性疾病和惡性腫瘤的新型疫苗的主要方向之一。

佐劑是與抗原同時或預先注射，可非特異性地增強或改變機體對抗原免疫應答的物質，選擇合適的佐劑是疫苗免疫效果的保證。理想的佐劑應能促進體液和細胞介導的免疫，也能作用于弱免疫性抗原，而且不引起有害的副作用，穩定且便宜容易生產[1]。

合成肽疫苗是一種新型疫苗，具有免疫原性高、生物安全性好、免疫持續期長、質量穩定性好、可有效區分免疫動物和感染動物的特點[2]。由于合成肽抗原本身分子小，免疫原性弱，需用特定的佐劑來增強其免疫原性。目前，市場上口蹄疫疫苗所用佐劑主要包括ISA 201VG、ISA 206VG、ISA 50V和ISA 50V2，而豬口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）主要使用的佐劑為ISA 50V2。ISA 50V2佐劑投入生產近4年來，客戶對豬口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）的免疫效果持肯定態度，但也有市場反饋合成肽疫苗注射阻力較滅活疫苗大。疫苗的注射阻力和疫苗黏度息息相關，黏度過大可導致注射阻力增大，應激反應增大，降低免疫效果，同時也影響肉制品質量。市場上ISA 50V2佐劑所制成的合成肽疫苗黏度一般在100cP左右，滅活疫苗的黏度一般在30cP左右，合成肽疫苗黏度較滅活大，可能會存在注射困難的現象。

低黏度、良好穩定性、免疫效果好、無副作用一直是合成肽疫苗工藝改進的方向。ISA 50V2佐劑的供應商法國SEPPIC公司，為降低合成肽疫苗的黏度，研發成功了新佐劑ISA 61VG。本試驗采用新佐劑ISA 61VG和原ISA 50V2佐劑進行乳化制成豬口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800），試驗新佐劑的乳化后的外觀、劑型、穩定性和黏度是否能夠達到質量標準的要求，其黏度是否能夠有效降低，并探討新佐劑替代現有佐劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水相：內含合成肽抗原多肽2 6 0 0（批號為SL3150621B1D1）、多肽2700（抗原批號為SL2150621B1D1）和多肽2800（抗原批號為SL1150624B1D1）各25μg/ml，申聯生物醫藥（上海）股份有限公司生產；

1.1.2 佐劑：ISA 61VG佐劑，法國SEPPIC公司生產，批號為QP45781；ISA 50V2佐劑，法國SEPPIC公司生產，批號為QP27845；

1.1.3 儀器：FA25剪切乳化機，剪切頭（20g、10g），梅特勒-托利多AB204-S分析天平，NDJ-5S型黏度計，LS-POP（8）激光粒度分析儀。

1.2 方法

1.2.1 疫苗配制

（1）50V2佐劑：按現有的豬口蹄疫O型合成肽疫苗（2600+2700+2800）乳化工藝（水油體積比1：1、乳化流速7000ml/min）制成疫苗。乳化10次。

（2）61VG佐劑：根據前期61VG佐劑乳化參數的篩選試驗所確定最優的61VG佐劑乳化工藝參數（水油重量比1：1、乳化流速8000ml/min），使用61VG佐劑乳化制成疫苗。乳化10次。

1.2.2 檢測方法與標準

（1）外觀：眼觀應為乳白色略帶黏滯性乳狀液。

（2）劑型：油包水型（W/O）。取一潔凈吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，第一滴不計，從第二滴開始，應呈油滴狀不擴散。

（3）穩定性：取出待檢樣品回溫至室溫（15℃～25℃），吸取疫苗10ml 放入相應的離心管中，于天平稱量平衡后以3000r/min離心15min，管底析出的水相體積應不得超過 0.5ml。

（4）黏度：取疫苗100ml，使用黏度計檢測，應不大于150cP。

（5）粒徑：選取白油作分散劑，以疫苗：白油為1：8至1：12的比例稀釋，作為待測樣品，使用LS-POP（8）激光粒度分析儀進行檢測，D50應為1.24～1.96μm。

2 結果

2.1 外觀

樣品目測均為乳白色略帶黏滯性液體，檢測結果均符合產品質量標準（見表1）。

2.2 劑型

樣品檢測均為油包水型，檢測結果均符合產品質量標準（見表1）。

2.3 穩定性

樣品離心后管底目測均無水相析出，檢測結果均符合產品質量標準（見表1）。

2.4 黏度

通過黏度計檢測，ISA 50V2制成的疫苗黏度均小于100cP，ISA 61VG制成的疫苗黏度均小于60cP，檢測結果均符合產品質量標準（見表1）。

2.5 粒徑

通過激光粒度分析儀檢測，ISA 50V2粒徑的D50值為1.28～1.81μm，符合企業內控質量標準，而ISA 61VG粒徑的D50值為1.74～2.07μm，不符合產品的企業內控質量標準。

3 討論

（1）ISA 61VG佐劑制成的豬口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）的外觀、劑型、穩定性和黏度均符合質量標準，且ISA 61VG的黏度較ISA 50V2佐劑顯著降低。ISA 50V2佐劑制成豬口蹄疫O型合成肽疫苗（2600+2700+2800）的黏度檢測結果范圍為97.4～98.6cP，平均黏度為98.01cP；ISA 61VG佐劑制成豬口蹄疫O型合成肽疫苗（2600+2700+2800）的黏度檢測結果范圍為51.4～52.8cP，平均黏度為52.23cP，下降了47%，下降顯著（p＜0.01）。

表1 疫苗檢測結果統計表

（2）ISA 61VG佐劑的粒徑檢測結果不符合現有的質量標準（D50范圍1.24～1.96μm）。由表3可以看出，ISA 61VG所制得疫苗的D50均值1.90μm比原有佐劑的D50均值1.67μm有所變化，現有的疫苗粒徑標準也是根據ISA 50V2佐劑制得疫苗的檢測結果所制定的內控標準。粒徑檢測結果的變化是由工藝的原因導致，還是ISA 61VG佐劑本身粒徑就和ISA 50V2佐劑不一致，這需要后續試驗數據進行證明。

（3）從試驗結果可以看出，新佐劑ISA 61VG制成疫苗的黏度下降顯著，ISA 61VG佐劑替代現有佐劑有很大可行性，后續可開展相關的動物免疫試驗，來綜合評定ISA 61VG佐劑。如能在降低疫苗的黏度的同時，有效地保證動物免疫效果，該佐劑即為目前豬口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）所需的優良佐劑。

（4）疫苗黏度影響因素包括佐劑種類和用量、乳化時間、水油比等[3]，從本試驗的結果來看，疫苗黏度和粒徑也存在一定的關聯。本試驗中疫苗黏度下降了47%，而粒徑D50值升高14%，可能具有一定的負相關。粒徑可作為疫苗工藝改進的一個新思路，進而探索乳化溫度控制、攪拌頻率、壓力等一系列乳化參數和粒徑的關系，有目的嘗試提高疫苗粒徑，來觀察能否達到降低疫苗黏度、提高疫苗質量的效果。

[1] 潘杭君，孫紅祥.免疫佐劑的研究進展[J].中國獸藥雜志，2004，38（1）：32-37.

[2] 史素云，楊志彪.豬O型口蹄疫的新型合成肽疫苗和傳統滅活疫苗的比較[J].農業開發與裝備，2015，（4）：54-56.

[3] 江心華，陳玉文.影響油乳劑疫苗黏度因數的探討[J].福建畜牧獸醫，2010，（2）：18-19.