五倍子物的提取及其對弧菌抑制作用的初步研究

朱珍珍 李青霞 鄧嘉儀 鄭梓唯 趙鋆偉 唐建洲

（長沙學院 生物與環境工程學院，湖南長沙 410022）

南美白對蝦自從引進以來就深受廣大對蝦養殖業者的喜愛，養殖規模就迅速擴大，短短幾年時間就發展成我國養殖面積最廣的對蝦。然而，近年來隨著養殖規模的不斷擴大和放養密度的增加，由細菌和病毒性疾病引發的病害也日趨嚴重，給養殖者造成了嚴重的經濟損失，已成為當前限制凡納濱對蝦養殖業持續發展的瓶頸問題。我國具有豐富的植物資源，應用植物藥來防治水產動物疾病有著悠久的歷史[1]。植物藥具有天然、環保、無藥物殘留、對病原微生物不易產生抗藥性、毒副作用較小等優點，也能提高水產動物的抗應激能力，因此植物藥的開發和利用受到國內外學者的廣泛關注，對飼料工業、水產養殖業以及環境保護與人類健康都具有重大的現實意義。

五倍子為蚜科昆蟲角倍蚜或倍蛋蚜在其寄主鹽膚木、青麩楊或紅麩楊等樹上形成的蟲癭，異名文蛤、百蟲倉、木附子等。研究表明，五倍子具有很強的抗菌作用，主要藥效成分單寧酸（Tannin Acid），又稱丹寧、鞣酸或鞣質。植物單寧酸具有天然、高效等優點，具有廣闊的開發前景和應用價值。臨床研究表明五倍子佐以慶大霉素、甲硝哇能增強殺菌效果，特別對銅綠假單抱菌、厭氧菌的作用尤為顯著，五倍子對羊毛樣抱子菌等真菌也有較強的抑制作用[2]。

本文對傳統的鹽酸提取法進行了優化，并研究了五倍子提取物對弧菌的抑制作用，為南美白對蝦健康養殖和可持續發展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 五倍子

本實驗所采用的五倍子為藥店購買。

1.1.2 弧菌

本實驗室保存的弧菌有副溶血弧菌ATCC17802、溶藻弧菌ATCC33787和創傷弧菌ATCC27562。

1.1.3 培養基

培養基主要為2216E液體培養基、2216E固體培養基，均購自青島高科園海博生物技術有限公司。2216E 半固體培養基配置方法：按照質量比 1：1 的比例稱分別取 2216E 固體培養基與 2216E液體培養基，后加入適量蒸餾水備用[3]。

1.2 實驗方法

1.2.1 五倍子提取物的制備

采用超聲波法優化傳統提取工藝提取五倍子有效成分，并采用液相色譜的方法分析提取物的濃度和純度。

1.2.2 單因子實驗設計

以溶劑濃度、溶劑倍量、超聲波時間和超聲波頻率為單因子水平開展提取實驗[4]（表1）。

表1 超聲波提取單因子參數

1.2.3 正交實驗設計

在單因子實驗的基礎上，本試驗采用正交表，對五倍子沒食子酸提取率影響最大的四個因素鹽酸濃度、溶劑倍量、超聲波時間和超聲波頻率4個因素，選擇3個水平進行優選。超聲方法為間歇超聲，即每超聲3秒，間歇3秒（見表2）。

表2 正交實驗設計表

1.2.4 實驗菌株的活化

實驗室保存的副溶血弧菌ATCC17802、溶藻弧菌ATCC33787和創傷弧菌ATCC27562三種弧菌凍干粉，進行活化處理，分別接種于2216E液體培養基中，溫度28℃、轉速180r/min的搖床上培養，備用。

1.2.5 體外弧菌抑制實驗

試驗不同濃度五倍子提取物對副溶血弧菌ATCC17802、溶藻弧菌ATCC33787和創傷弧菌ATCC27562的抑制作用，設計五倍子提取物的濃度梯度0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1 g/ml，研究五倍子提取物的體外抑制弧菌效果，獲得抑制弧菌生長與繁殖的最佳五倍子提取物濃度[5-6]。

2 結果與分析

2.1 五倍子提取物含量分析

五倍子提取物標準物進樣量為10μl，保留時間為4.851min，峰面積為3226273。

2.2 單因子實驗對五倍子提取物的提取量的影響

2.2.1 鹽酸濃度對五倍子提取物提取量的影響

用不同倍量的鹽酸水解五倍子粉末后所檢測出的峰面積是不同的，但是當變量是溶劑倍量時，峰面積的大小不能代表沒食子酸的含量。但是，根據標準樣品測出的濃度與峰面積的關系。就可以通過不同倍量峰面積大小求出相應的沒食子酸濃度，再用濃度乘以相應水解倍數（10倍、20倍、30倍、40倍、50倍）便能得到沒食子酸含量。在鹽酸濃度、溶劑倍量、超聲波時間和超聲波頻率一定的條件下，當鹽酸濃度為1mol/L時，其液相色譜峰面積最大，能提取出五倍子有效成分的含量最多，此為最佳濃度。

2.2.2 溶解倍數對五倍子提取物提取量的影響

五倍子粉末在酸性溶液（HCl）中水解后，其中的主要成分—鞣質被水解成沒食子酸，然后將其置于超聲波儀器中提取，最后用高效液相色譜法（HCLP）檢測其中的沒食子酸含量。在鹽酸濃度為6M時，進料量為10μl，當溶解倍數為20倍時，五倍子提取物的液相色譜圖的峰面積值最大，所以由此得出提取五倍子提取物的最佳溶解倍數為20倍。

2.2.3 超聲波時間對五倍子提取物提取量的影響

沒食子酸的含量測定采用HPLC法。具體方法為：五倍子粉末在酸性溶液（HCl）中水解后，其中的主要成分—鞣質被水解成沒食子酸，然后將其置于超聲波儀器中提取，將提取液在12000rpm、5min條件下離心后，進樣。在進料量為10μl，鹽酸濃度為6M，提取五倍子提取物的超聲波時間是5min時，峰面積最大，則此時間為最佳提取時間。

2.2.4 超聲波時頻率對五倍子提取物提取量的影響

當變量是超聲波提取功率時，峰面積的大小正是代表了所提取出的沒食子酸的含量。由圖5可知，超聲波功率在40～200W范圍之間時，峰面積大小變化是沒有準確的規律可循的，但是超聲波功率調整到200W之后，峰面積與超聲波功率呈正比關系，而后，峰面積大小與超聲波功率呈負相關。在其他條件不變、超聲波提取功率在240W時，其液相色譜峰面積最大。所以提取五倍子主要物質—鞣質時，最佳的超聲波提取功率為240W。

2.3 正交優化實驗下五倍子提取物的最佳提取條件

最佳的提取五倍子提取物的條件是1mol/L HCl、溶解倍數為20倍、超聲波20min 和頻率240W。

2.4 不同濃度的鹽酸提取的五倍子提取物抑菌效果

在一定的條件下，五倍子提取物濃度的越高，其對副溶血弧菌、創傷弧菌和溶藻弧菌等弧菌的抑制作用也越大，且隨著五倍子提取物的濃度的提高，其對弧菌的抑制效果增大，呈線性關系。

3 討論

本實驗對五倍子提取物的提取率進行了系統的研究，五倍子天然抗菌物質的提取采用超聲輔助酸提取法，結果表明，鹽酸濃度、溶劑倍量、超聲波時間和超聲波頻率對五倍子提取物的提取量均有影響。最佳提取工藝條件為：1mol/L HCl、溶劑的溶解倍數為20倍、超聲波提取時間為20min 和頻率240W。

五倍子是一種天然的植物抑菌物質，我們采用鹽酸溶解五倍子粉末，通過用探究到的最佳提取工藝條件，得到五倍子提取物，并考察了該提取物對供試的3種病原菌的抑菌效果，發現五倍子鹽酸提取物中的抑菌成分對供試的三種菌均有明顯的抑菌作用，最小的抑菌濃度分別為：副溶血弧菌0.0625 g/ml，創傷弧菌0.03125 g/ml，溶藻弧菌0.03125 g/ml。通過實驗探究的抑菌效果，證明，在1mol/L HCl、溶劑的溶解倍數為20倍、超聲波提取時間為20min 和頻率240W的提取工藝條件下、在0-1g/ml 五倍子提取物的范圍內，1 g/ml五倍子酸提取物對副溶血弧菌、溶藻弧菌、創傷弧菌的抑菌效果均為最佳。

本文初步考察了五倍子鹽酸提取物的提取工藝及其抑菌效果，而對于提取五倍子有效成分的最佳溶解劑（如水、醇等）還未得到確認，因此，下一步工作將對提取五倍子有效成分的溶解劑進行實驗探究，并對比出最佳溶解劑，以期五倍子提取物能夠發揮更好的抑菌效果。

[1] 宋靖芳.中草藥對魚類病原氣單胞菌、弧菌的體外抑制作用研究[D].華南師范大學，2004.

[2] 邱慶連，潘清清，張友平，等.五倍子、烏梅等45種中草藥提取物對鋸緣青蟹致病弧菌的抑菌作用研究[J].浙江海洋學院學報（自然科學版），2010，（1）：34-38.

[3] 彭勇. 副溶血噬菌體的分離鑒定、裂解性能及其在副溶血弧菌的快速檢測中的初步應用[D].中國海洋大學，2013.

[4] 李紅然，付大友，李艷清，等.超聲微波協同萃取-HPLC測定五倍子中的沒食子酸含量[J].化工時刊，2011，（1）：36-38，41.

[5] 金周浩.副溶血弧菌的分子檢測與基因分型研究[D].浙江工商大學，2008.

[6] 羅詞興，黃旭雄，李桑，等.溶藻弧菌感染后凡納濱對蝦鰓組織免疫相關基因的表達[J].中國水產科學，2014，（1）：189-196.