基于空氣動力輔助離子化-超高分辨質譜成像技術的大鼠腎臟組織中多種類代謝物的分布研究

王中華 何秉淑 孫成龍 宋肖煒 賀玖明 張瑞萍 再帕爾·阿不力孜*,

1(中央民族大學生命與環境科學學院，生物成像與系統生物學研究中心， 北京 100081) 2(中國醫學科學院/北京協和醫學院藥物研究所，天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室， 北京 100050)

1 引 言

質譜成像(Mass spectrometry imaging，MSI) 是將成像處理軟件與質譜的離子掃描技術相結合的一種新型成像方法，可在分子水平上對生物組織內的分子“直接”分析，獲取其含量和空間分布信息[1,2]。腎臟是重要的代謝和排泄器官，小分子代謝物代謝異常在糖尿病腎病等多種腎病的發生過程中具有重要作用，全面了解其在腎臟組織中的含量及分布特征，有助于揭示腎臟疾病的發病機制、發現具有組織特異性的生物標志物[3～5]。目前，MSI技術主要包括以下三大類型: 需要在真空條件下進行離子化的二次離子質譜(SIMS)， 基質輔助激光解吸電離(MALDI)質譜，以及近幾年發展起來的以解吸電噴霧電離(DESI)為代表的敞開式離子化質譜成像技術等[6～10]。其中，SIMS成像技術主要應用于樣品表面的元素分析。MALDI-MSI是最成熟、應用最為廣泛的質譜成像技術，尤其適用于蛋白質、多肽等生物大分子的成像分析[6,7]，近年來，隨著新型基質的開發，其也被應用在小分子成像分析領域。如Liu等[11]采用基于新型耐鹽基質的MALDI-MSI質譜成像技術研究了腎纖維化的發病機制，發現腎纖維化動物模型中與糖酵解、三羧酸循環、脂肪酸代謝、抗氧化劑等代謝網絡相關的21種小分子代謝物的含量及分布特征發生了顯著變化。與MALDI-MSI相比，DESI-MSI技術具有可在開放環境下操作、使用便捷，且樣品前處理簡單、無需添加基質等優點，在小分子代謝物成像分析方面具有廣闊的應用前景[9,10]。如Dill等[12]采用DESI-MSI技術比較了乳頭狀腎細胞癌的癌組織與癌旁組織脂類代謝物的整體輪廓差異，結果表明，DESI-MSI技術結合多元統計分析可準確區分癌組織與正常組織，可應用于疾病分子病理診斷。本課題組前期自主研發出新型敞開式空氣動力輔助離子化(Air flow assisted ionization, AFAI；或稱之為Air flow assisted desorption electrospray ionization, AFADESI；以下統稱為AFAI)及其免標記、便捷、高靈敏的質譜分子成像新技術(AFAI-MSI)，并成功應用于候選新藥作用機制和腫瘤生物標志物的原位篩查及免標記分子病理診斷的研究[13,14]。本研究建立了基于AFAI-MSI技術檢測大鼠腎臟組織中小分子代謝物的分布特征的質譜成像分析方法，為AFAI-MSI技術在腎臟疾病研究中的應用提供了重要依據。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

AFAI-MSI成像系統平臺，采用Q Exactive型四極桿-靜電場軌道離子阱質譜儀(美國Thermo Scientific公司)，拆卸原有商業離子源，通過自制離子源接口安裝AFAI 離子源，并配有Xcalibur 2.2數據采集與處理系統；UltiMate 3000系列超高效液相色譜儀(美國Thermo Scientific公司)，包括二元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器(配有恒溫箱)、柱溫箱、二極管陣列檢測器；CM 1860冷凍切片機(德國Leica Microsystem公司)。乙腈、異丙醇(色譜純，Merck公司)，實驗用水為某品牌純凈水。8周齡SD大鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

2.2 腎臟組織樣本的制備

將2只雌性SD大鼠于高濃度CO2條件下處死，立即摘取腎臟組織，用超純水沖洗掉外周血跡后迅速置于液氮中冷凍，于-80℃保存。

2.3 組織切片的制備

將組織從-80℃冰箱轉移至CM 1860冷凍切片機(操作溫度為-20℃)，連續獲取相鄰兩個厚度為8 μm的腎臟組織切片，分別置于兩個載玻片上，然后真空干燥30 min。

2.4 質譜條件

采用正離子全掃描模式，掃描范圍為70～1000 Da，質量分辨率設為70000，自動增益控制目標值為3×106，最大注入時間為200 ms。噴霧電壓為7 kV，傳輸管電壓為3 kV，噴霧氣(氮氣)壓力為0.6 MPa，噴霧溶劑(異丙醇-乙腈-水，4∶4∶2，V/V)流速為5 μL/min，空氣輔助氣流速為45 L/min。數據采集采用Xcalibur 2.2軟件(美國Thermo Scientific公司)。

2.5 數據處理方法

利用Xcalibur 2.2軟件將原始數據文件轉換為cdf格式，隨后采用本課題組與科邁恩(北京)科技有限公司合作研制的質譜成像軟件MassImager(質譜成像系統工作站v1.0版)進行文件讀取，以檢測離子的種類、相對強度和空間位置，進行成像分析[15]。

3 結果與討論

3.1 溶劑的選擇

溶劑的極性、粘度、表面張力、介電常數等理化性質是影響噴霧溶劑將目標分子從組織內萃取、解吸、電離的因素。采用甲醇、乙腈、異丙醇和水作為噴霧溶劑，以質譜峰個數和強度為監測指標，分別對溶劑組成和比例進行了優化。結果表明，采用乙腈-異丙醇-水(4∶4∶2,V/V)作為噴霧溶劑，對小分子代謝物的檢測效果最佳。

3.2 方法穩定性考察

制備寬度和間隔均為3 mm的羅丹明B紅色條帶，對其進行AFAI-MS分析，以m/z443.2離子強度為監測指標，連續測定3天，考察了分析系統的穩定性[16]。結果表明，m/z443.2離子峰面積的相對標準偏差(Relative standard deviation，RSD)<20%，表明AFAI-MS分析方法的重復性良好。

3.3 AFAI-高分辨質譜檢測分析

應用空氣動力輔助離子化-超高分辨質譜對腎臟組織冰凍切片進行了原位分析，結果表明，在正離子模式下能夠檢測到信號強度103～107的離子共498個(去除同位素)，檢測到的離子類型包括[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+、[2M+Na]+和[2M+K]+等。利用其精確質荷比信息，在Metlin、HMDB、LIPID MAPS等數據庫中檢索可能的分子式及代謝物，結合同位素豐度比、不同類型加合離子之間的精確質荷比差值以及文獻報道等信息，分析推測代謝物的可能結構，共發現38種不同種類的內源性代謝物(表1)。從表1可見，這些代謝物的分子量在100～900 Da之間均有分布，其質量偏差均在5 ppm以內，分別屬于有機胺、糖、神經遞質、維生素、多肽、有機酸、甘油磷脂、鞘脂、甘油脂、固醇酯等不同的代謝物類型，表明建立的基于超高分辨質譜的AFAI-MS分析方法可適用于腎臟組織中含量差異較大的不同分子量和結構類型的多種小分子代謝物的原位分析，并能獲得準確的分子信息。

表1 從腎臟組織中發現的38種內源性代謝物

Table 1 38 kinds of metabolites identified in rat kidney tissues

名稱aName實測質荷比Measured(m/z)理論質荷比Theoretical(m/z)質量偏差bDeviationofmass(δ)分子離子Molecularions膽堿Choline104．1074104．10703．84[M+H]+甜菜堿Betaine118．0864118．08630．85[M+H]+牛磺酸Taurine126．0221126．02200．79[M+H]+肌酐Creatinine136．0482136．04810．74[M+Na]+N?甲基尼克酰胺N?methylnicotinamide137．0710137．07090．73[M+H]+乙酰膽堿Acetylcholine146．1175146．1176-0．68[M+H]+肉堿Carnitine162．1124162．1125-0．62[M+H]+乙酰精氨Acetylspermidine188．1757188．17570．00[M+H]+甘油磷酸Glycerolphosphate195．0029195．00290．00[M+Na]+葡萄糖Glucose203．0526203．05260．00[M+Na]+山梨醇Sorbitol205．0683205．06830．00[M+Na]+磷酸膽堿Phosphocholine206．0552206．05520．00[M+Na]+泛酸PantothenicAcid242．0996242．0999-1．24[M+Na]+甘油磷脂酰乙醇胺Glycerylphosphorylethanolamine254．0189254．0190-0．39[M+K]+硫胺素Thiamine265．1115265．1118-1．13[M+H]+甘油磷脂酰膽堿Glycerophosphocholine280．0918280．0920-0．71[M+Na]+檸檬酸鈉Sodiumcitrate332．9559332．9571-3．60[M+K]+精氨酸?羥基天冬氨酸酸或羥基精氨酸?天冬氨酸酸Lys?Asp?OHorAsp?Lys?OH392．1052392．1064-3．06[M+Na]+1?(3?甲基丁酰基)?6?芹菜糖基葡萄糖1?(3?Methylbutanoyl)?6?apiosylglucose397．1707397．17050．50[M+H]+硬脂酰基肉堿Stearoylcarnitine428．3732428．3735-0．70[M+H]+MG(18∶0)381．2973381．2975-0．52[M+Na]+LysoPC(16∶0)518．3214518．3217-0．58[M+Na]+PC(18∶2)558．2952558．2956-0．72[M+K]+PC(18∶1)560．3102560．3112-1．78[M+K]+PC(20∶4)582．2960582．29560．69[M+K]+PG(22∶4)583．2990583．3006-2．74[M+Na]+PA(30∶0)607．4694607．4697-0．49[M+H]+CE(20∶4)695．5730695．5737-1．01[M+Na]+Cer(44∶1)700．6570700．6578-1．14[M+Na]+SM(34∶2)723．5405723．5411-0．83[M+Na]+SM(34∶1)739．5137739．5150-1．76[M+K]+PG(34∶1)771．5121771．5146-3．24[M+Na]+PE(38∶5)788．4958788．4990-4．06[M+K]+PG(36∶2)797．5277797．5302-3．13[M+Na]+PC(38∶5)804．4969804．49403．60[M+K]+SM(42∶3)833．6485833．6507-2．64[M+Na]+PC(40∶8)852．5501852．5514-1．52[M+Na]+LacCer(d32∶1)872．5490872．5495-0．57[M+K]+a，脂類化合物的簡稱：化合物名(碳原子數：雙鍵數)，MG：甘油單酯，LysoPC：溶血磷脂酰膽堿，PC：磷脂酰膽堿，PG：磷脂酰甘油，PA：磷脂酸，CE：膽固醇酯，Cer：神經酰胺，SM：鞘磷脂，PE：磷脂酰乙醇胺，LacCer：乳糖神經酰胺。b，質量偏差：質量偏差=(實測質量數-理論質量數)/理論質量數×106。a，Abbreviationoflipidcompounds：Compoundname(NumberofCarbons：Numberofdoublebonds)，MG：Monoglycerides，LysoPC：Lyso?phosphatidylcholine，PC：Phosphatidylcholine，PG：Phosphatidylglycerol，PA：Phosphatidicacid，CE，Cholesterylester，Cer，Ceramide，SM：Sphingomyelin，PE：Phosphatidylethanolamine，LacCer：Lactosylceramide．b．Deviationofmass：Deviationofmass=(Measuredmass-the?oreticalmass)/Theoreticalmass×106．

3.4 代謝物的質譜成像分析

膽堿及其代謝物在腎組織中的分布情況如圖1所示，膽堿是細胞膜、線粒體膜和神經遞質乙酰膽堿的組成成分，參與脂代謝、信號傳導、生物分子的翻譯后修飾、核受體的激活、細胞膜的流動性調控等多種生命過程[17]。從圖1可見，膽堿在腎臟組織中分布廣泛，在腎皮質和腎乳頭區域含量最高。

圖1 膽堿及其代謝物在大鼠腎組織中的分布: (A) 膽堿， (B) 乙酰膽堿， (C) 甜菜堿， (D) 磷酸膽堿， (E) 甘油磷酸膽堿Fig.1 Distribution of choline and its metabolites in rat kidney tissues: (A) Choline, (B) Acetylcholine, (C) Betaine, (D) Phosphocholine, and (E) Glycerophosphocholine

乙酰膽堿是膽堿在膽堿乙酰基轉移酶的作用下合成的，可促進水和離子的排出。本研究發現乙酰膽堿主要分布于近髓皮質區域，可能與膽堿乙酰基轉移酶在腎皮質集合管中的特異性分布有關[18]。

甜菜堿和甘油磷脂酰膽堿分別是膽堿的氧化和磷酸化代謝產物，分別在腎臟外髓質和腎乳頭區域有特異性分布。據報道，甜菜堿和甘油磷脂酰膽堿是腎臟中重要的滲透保護劑，參與腎臟皮質-髓質軸向滲透壓梯度的形成，并且能夠對抗高尿素環境對腎髓質細胞的損害作用，維持細胞內生物大分子的正常結構和功能[19]。甜菜堿在外髓質區域含量很高，不僅可以檢測到[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+等準分子離子，還能檢測到較強的 [2M+Na]+、[2M+K]+等準分子離子峰，這些離子在腎臟組織中分布特征基本一致(圖2)。

圖2 甜菜堿的5種分子離子在大鼠腎組織中的分布: (A) [M+H]+，(B) [M+Na]+，(C) [M+K]+，(D) [2M+Na]+，(E) [2M+K]+Fig.2 Distributions of five molecular ions of betaine in rat kidney tissue: (A) [M+H]+, (B) [M+Na]+, (C) [M+K]+, (D) [2M+Na]+, (E) [2M+K]+

磷酸膽堿在皮質和外髓質部分具有少量分布，且主要分布在腎乳頭區域，推測其可能參與腎臟皮質-髓質軸向滲透壓梯度的形成。文獻[19]中曾將皮質和髓質分離，分別進行提取后， 再測定磷酸膽堿的含量，但未檢測到磷酸膽堿，推測可能與所采用的方法的靈敏度較低有關。

此外，本研究還發現了多種有機胺、糖、維生素、肉堿和有機酸類小分子代謝物在腎臟的不同組織區域呈特征性分布(圖3)，推測它們在腎臟細胞保護、滲透壓的調節、神經遞質代謝調控等方面具有重要作用[19～22]。例如，本研究發現硫胺素(維生素B1)主要分布在腎臟近髓皮質部分，與乙酰膽堿具有相似的分布特征。有研究表明，維生素B1是乙酰膽堿代謝的重要調控因子，可抑制膽堿酯酶的活性，維生素B1的缺乏可導致此酶活性升高和乙酰膽堿的分解代謝增加，而補充維生素則可以提高乙酰膽堿的水平[22]。此外，維生素B1在體內可轉變成硫胺素焦磷酸，參與糖在體內的代謝。因此，維生素B1缺乏時，可導致糖代謝紊亂；而增加維生素B1的攝入可改善糖尿病導致的腎臟損傷，具有逆轉早期糖尿病、腎病的作用[23]。

圖3 有機胺、糖、維生素、肉堿和有機酸類代謝物在大鼠腎組織中的分布: (A) 肌酐，(B) N-甲基尼克酰胺，(C) 乙酰膽堿，(D) 精氨酸-羥基天冬氨酸酸或羥基精氨酸-天冬氨酸酸，(E) 甘油磷脂酰乙醇胺，(F) 葡萄糖，(G) 山梨醇，(H) 1-(3-甲基丁酰基)-6-芹菜糖基葡萄糖，(I) 甘油磷酸，(J) 檸檬酸鈉，(K) 硫胺素，(L) 牛磺酸，(M) 泛酸，(N) 肉堿，(O) 硬脂酰基肉堿。Fig.3 Distribution of metabolites of organic amine, sugar, vitamins, peptides and organic acids in rat kidney tissues: (A) Creatinine, (B) N-methylnicotinamide, (C) Acetylspermidine, (D) Lys-Asp-OH or Asp-Lys-OH, (E) Glycerylphosphorylethanolamine, (F) Glucose, (G) Sorbitol, (H) 1-(3-Methylbutanoyl)-6-apiosylglucose, (I) Glycerol phosphate, (J) Sodium citrate, (K) Thiamine, (L) Taurine, (M) Pantothenic Acid, (N) Carnitine, (O) Stearoylcarnitine.

圖4是脂類代謝物在腎臟組織中的分布特征圖。脂類代謝物具有許多重要的生物學功能，參與調節多種生命活動過程，包括能量轉換、物質運輸、信息識別與傳遞、細胞發育和分化、細胞凋亡等[24,25]。本研究建立的AFAI-MSI質譜成像方法可檢測到溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、甘油磷脂酸、鞘磷脂、神經酰胺、甘油單酯、固醇酯等脂類代謝物。這些脂類代謝物在腎臟組織中呈不均勻分布，可能與腎臟組織不同區域具有不同的結構和功能有關。

圖4 脂類代謝物在大鼠腎組織中的分布: (A) LysoPC (16∶0)，(B) PC(18∶1)，C∶ PC(18∶2)，(D) PC(20∶4)，(E) PC(38∶5)，(F) PC(40∶8)，(G) PE(38∶5)，H∶ PG(22∶4)，(I) PG(34∶1)，(J) PG(36∶2)，(K) PA(30∶0)，(L) SM(34∶1)，M∶ SM(34∶2)，(N) SM(42∶3)，(O) Cer(44∶1), (P): LacCer(d18∶1/14∶0)， (Q) MG(18∶0)，(R) CE(20∶4)Fig.4 Distribution of lipids in rat kidney tissues: (A) LysoPC (16∶0), (B) PC(18∶1), (C) PC(18∶2), (D) PC(20∶4), (E) PC(38∶5), (F) PC(40∶8), (G) PE(38∶5), (H) PG(22∶4), (I) PG(34∶1), (J) PG(36∶2), (K) PA(30∶0), (L) SM(34∶1), (M) SM(34∶2), (N) SM(42∶3), (O) Cer(44∶1), (P) LacCer(d18∶1/14∶0), (Q) MG(18∶0), (R) CE(20∶4)

4 結 論

建立了基于空氣動力輔助離子化-高分辨質譜技術檢測大鼠腎臟組織中小分子代謝物分布的質譜成像分析方法。本方法無需樣品預處理, 靈敏度高，代謝物覆蓋范圍寬，可直接獲取多種類型、含量差異達4個數量級的內源性代謝物的結構、含量及空間分布信息。因此，本方法有望應用于腎臟中內源性代謝物的原位表征和代謝調控機制研究，為探究代謝物在糖尿病、腎病、慢性腎炎、急性腎衰等多種急慢性腎病中的作用等提供一種新的分析方法。

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