一株APMV-4毒株的分離鑒定及其PCR檢測方法的建立*

楊金興，袁小遠，孟凱，李莉，王友令

（山東省農業科學院家禽研究所，山東 濟南 250023）

副黏病毒科腮腺炎病毒屬的APMVs分為9個血清型(APMV 1～9)。在所有血清型當中，最為熟悉的是新城疫病毒，它是禽副黏病毒1型的代表毒株；但是針對APMV 2～9的研究非常少[1,2]。APMV-4的基因組全長是15054個核苷酸，并與副黏病毒的“六規則”一致。和NDV相同，APMV-4基因組也包含6個非重疊的基因：NP（核蛋白）、P（磷酸化蛋白）、M（膜蛋白）、F（融合蛋白）、HN（血凝素-神經氨酸酶蛋白）和L（RNA依賴性聚合酶）。本研究對分離鑒定的APMV-4型毒株進行PCR檢測，建立的檢測方法可有效地區分APMV-1型和APMV-4型毒株，為APMV-4的研究提供重要的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株及其背景資料、試驗動物 APMV-1所用毒株為NDV的GM強毒株、APMV-4 QY毒株均由山東省SPF雞研究中心分離鑒定保存。NDV抗原和血清、SPF雞胚均來自山東省SPF雞研究中心。

1.1.2 試劑 RNA提取試劑盒購自百泰克生物公司、One step RT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 毒株分離鑒定 病鴨的組織 （氣管、肝臟等）按1：2體積加入滅菌生理鹽水，研磨、無菌處理、離心后取上清，按0.1ml/枚的接種量接種9日齡SPF雞胚3個，棄去24h內的死胚，每6h照蛋一次。收集尿囊液，按常規方法進行血凝和血凝交叉抑制試驗。

1.2.2 PCR方法的建立

1.2.2.1 引物設計 參照GenBank中APMV-4的全基因組序列 （No：KC439346）設計 1對引物APMV4-F/R。引物由華大基因公司合成，PAGE plus級別純化。

APMV4-F：5′-TCACAAGGACTCGAGGCAAC-3′

APMV4-R：5′-TCAATTTCGAGGTCGGCACA-3′。預計擴增約800bp。

1.2.2.2 RNA提取 取GM和QY毒株各200μl的尿囊液來提取病毒RNA，提取過程按照百泰克生物公司的RNA提取操作進行，最后用25μl DEPC水來溶解RNA，提取后立即進行后續的RT-PCR。

1.2.2.3 一步法RT-PCR檢測和敏感性試驗

50μl的 RT-PCR 體系如下：RNA 模板 10μl、2×PCR Buffer（含 dNTP） 25μl、混合酶（RTase、HS-taq、RNase inhibitor）2μl、Primer-F/R (20μm) 各1μl、RNase-free H2O 補充至 50μl，設 NDV GM 的RNA和水作為對照。RT-PCR反應條件經優化確定為：RT 42min 30℃，94℃ 3min；隨后進行 PCR擴增 94℃ 20s、50℃ 30s、72℃ 30s 進行 35 個 循環，最后72℃延伸4min。取5μl反應產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外觀察條帶。將分離毒株原液進行10倍的倍比稀釋，隨后同樣進行上述RTPCR操作，確定該方法的敏感性。

2 結果

2.1 毒株分離 HA檢測證實分離毒具有血凝性，效價為4～51og2。HI交叉抑制試驗表明其與AIV、NDV、IBV、EDS均無交叉反應。經隨機引物擴增，序列測定、blast比對確定其為APMV-4病毒。

2.2 RT-PCR 擴增 APMV-4分離毒株PCR擴增得到預期大小的擴增片段，約0.8kb。對照組GM NDV（即APMV-1病毒）在此處未出現擴增條帶，見圖1。

2.3 敏感性試驗 將分離毒株原液進行10倍的倍比稀釋，隨后同樣進行RT-PCR操作。擴增結果顯示本方法的檢測最小量可為102EID50，說明建立的檢測方法靈敏性較好。

圖1 一步法RT-PCR檢測結果

2.4 臨床應用 選取14份動物攻毒試驗后的組織樣品進行上述One-step RT-PCR方法的檢測。結果檢測出了11株陽性樣品，經序列比對證實為APMV-4病毒。

3 討論

針對APMV-4的研究較少，國內只檢索到其熒光定量檢測方法的文章[3]。近幾年來從香港、韓國、南非等地陸續有家養禽、野禽等分離到毒株的報道[4,5]。APMV 2～9誘導NDV感染的機體產生的免疫保護能力也不盡相同[6]。SH Kim等構建了APMV-4的反向遺傳系統，證實F蛋白裂解位點的氨基酸序列并不是病毒感染力的決定因素[7]。

本文建立了可用于檢測APMV-4的一步法RT-PCR方法，該方法能克隆微量mRNA而不需構建cDNA文庫，即cDNA合成與PCR反應在同一Buffer及酶中進行，減少了反應時間。特異性試驗表明本方法特異性強，與新城疫病毒(NDV)無交叉反應；靈敏度高，檢測最小量可為102EID50。因此，本文所建立的一步法的RT-PCR技術具有快速、準確、靈敏等優點，可用于APMV-4樣品的檢測，非常適合基層實驗室的應用。

[1] Alexander D J.Newcastle disease and other avian paramyxoviruses[J].Revue Scientifique Et Technique,2000,19(2):443-62.

[2] Swayne D E.Newcastle Disease,Other Avian Paramyxoviruses,and Avian Metapneumovirus Infections[M].Diseases of Poultry,2013:87-138.

[3] 王靜靜,劉華雷,王英麗,等.禽副黏病毒4型熒光RT-PCR檢測方法的建立 [J].中國動物檢疫,2014(3):68-71.

[4] Abolnik C,De C M,Rees J.Full genomic sequence of an African avian paramyxovirus type 4 strain isolated from a wild duck[J].Virus Genes,2012,45(3):537-541.

[5] Nayak B,Kumar S,Collins P L,et al.Molecular characterization and complete genome sequence of avian paramyxovirus type 4 prototype strain duck/Hong Kong/D3/75[J].Virology Journal,2008,5(1):124-124.

[6] Nayak B,Dias F M,Kumar S,et al.Avian paramyxovirus serotypes 2-9(APMV-2-9)vary in the ability to induce protective immunity in chickens against challenge with virulent Newcastle disease virus (APMV-1)[J].Vaccine,2012,30(12):2220-2227.

[7] Kim S H,Xiao S,Shive H,et al.Mutations in the Fusion Protein Cleavage Site of Avian Paramyxovirus Serotype 4 Confer Increased Replication and Syncytium Formation In Vitro but Not Increased Replication and Pathogenicity in Chickens and Ducks[J].Plos One,2013,8(1):e50598.□

食尚資訊 冬季食療養生首選海參，海參哪些吃法最受歡迎

冬季滋補吃什么？大雪掀起海參熱。

在大連、山東一帶，許多人剛過秋天就開始囤購海參，因為海參中富含的氨基酸、海藻素等有助于人們提高抵御疾病的能力，減少病毒性感冒的患病幾率，也能減少陳年疾病的復發。就病理生理學方面而言，首先，冬天氣溫低，毛細管收縮，外周阻力增大，高血壓，腦溢血的風險有所增加，而研究表明海參有明顯的舒展血管的功效；其次，冬天人們的運動量明顯減少，寒冷還容易使人內分泌失調，誘發支氣管炎、肺炎等，海參的粘多糖有提高人體免疫力的作用。在滋補養生方面，海參更具有“八珍之首”之稱，可以養血潤燥、補腎固本。

保全營養不流失，海參做法有講究。

海參是一種低膽固醇、低脂肪、高蛋白的食物，營養價值豐富，為了在食用過程中營養成分最大吸收，海參的做法也很有講究。宮品海參相關負責人向我們介紹了海參的常見做法：

一、燉是海參最正確、最健康的做法。海參與瘦豬肉、雞肉、羊肉一起小火燉煮或煲湯，肉質鮮嫩，湯汁鮮美，能緩解腸燥便秘、小便頻數。切記高溫，容易導致營養成分的分解流失。

二、熬粥也是冬季海參的最佳食用方法之一。配上枸杞、胡蘿卜等熬粥，味道鮮美，有利于海參自身營養的釋放，并且容易操作。

三、水煮海參的營養價值雖不及前兩種，但寒冬臘月，水煮海參確也不失為一種家常的做法，方便快捷，先武火燒沸，在文火煮上半小時即可。

四、海參的錯誤打開方式，海參最忌諱紅燒，因為紅燒會使營養成分大量流失，滋補效果大大降低。另外，做海參時切忌使用高壓鍋，鍋內過高的溫度也會造成營養物質的流失。