全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定蛋白飲料中蛋白質(zhì)的不確定度分析

唐 靜，羅 玥，黃 萍，蔣麗娜

(四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川成都 610100)

蛋白質(zhì)含量是食品營(yíng)養(yǎng)成分的重要指標(biāo)之一，其檢測(cè)質(zhì)量直接影響對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的評(píng)價(jià)。對(duì)測(cè)定結(jié)果不確定度的評(píng)定已成為通過中國(guó)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)的必要條件之一。蛋白飲料是目前消費(fèi)者喜愛的飲料，有些消費(fèi)者甚至想通過飲用蛋白飲料來補(bǔ)充蛋白質(zhì)，因此，對(duì)于蛋白飲料中蛋白質(zhì)含量的不確定度分析是很有必要的，它有助于消費(fèi)者對(duì)蛋白飲料的正確認(rèn)識(shí)以及選購。有關(guān)蛋白質(zhì)測(cè)定不確定度評(píng)定的研究報(bào)道較多[1-2]，目前也有一些用自動(dòng)定氮儀測(cè)定蛋白質(zhì)的不確定度評(píng)定的報(bào)道[3-5]，但是用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定蛋白飲料中蛋白質(zhì)的不確定度分析鮮有報(bào)道。該研究依據(jù)JJF1059—1999《測(cè)量不確定度評(píng)價(jià)與表示》[6]建立了以核桃花生奶為試驗(yàn)對(duì)象的不確定度評(píng)定方法，識(shí)別出測(cè)定過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，重點(diǎn)關(guān)注關(guān)鍵環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，以期有效地提高檢測(cè)工作的質(zhì)量，為消費(fèi)者提供可靠的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1樣品。試驗(yàn)對(duì)象為核桃花生奶，為國(guó)家抽檢樣品。

1.1.2試劑。濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、硼酸、氫氧化鈉、甲基紅、溴甲酚綠、95%乙醇，均為分析純。鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 mol/L)，根據(jù)GB/T 601—2016《化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備》[7]配制、標(biāo)定而成。

1.1.3儀器。8400型全自動(dòng)凱氏定氮儀、消化爐均為丹麥FOSS公司所生產(chǎn)；電子分析天平；滴定管50 mL，A級(jí)。

1.2方法

1.2.1方法原理。檢測(cè)方法參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[8]。核桃花生奶與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解的氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后，再以鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)鹽酸消耗量計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

1.2.2試樣處理。稱取10～20 g試樣，至于消化管中，加催化劑和16 mL濃硫酸，于8400型全自動(dòng)凱氏定氮儀的消化爐中集中加熱，采取梯度緩慢升溫的方式。消化完全后，取下消化管，冷卻至室溫，按照儀器說明書進(jìn)行蒸餾測(cè)定。根據(jù)所消耗的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，求出蛋白質(zhì)含量。

1.2.3建立數(shù)學(xué)模型。蛋白質(zhì)含量計(jì)算公式如下：

(1)

式中，X為試樣中蛋白質(zhì)含量(%)；V1為試樣消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)；V0為空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)；C為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mol/L)；m為試樣質(zhì)量(g)；0.014 0為每毫摩爾質(zhì)量氮的克數(shù)；F為氮換算成蛋白質(zhì)的系數(shù)，此處蛋白飲料為6.25。

由于各分量相互獨(dú)立，得出X的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定傳播率為

(2)

式中，ur(rep)為平行重復(fù)試驗(yàn)的相對(duì)擴(kuò)展標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2 結(jié)果與分析

2.1測(cè)定不確定度的來源及計(jì)算

2.1.1檢測(cè)過程重復(fù)性的不確定度。表1為測(cè)定花生核桃乳中蛋白質(zhì)的8次平行試驗(yàn)結(jié)果，測(cè)定覆蓋該方法的全過程，即稱量、消化、自動(dòng)蒸餾和滴定。

表1 蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果

ur(rep)=0.004 49

2.1.2全自動(dòng)凱氏定氮儀自動(dòng)滴定引入的不確定度。根據(jù)全自動(dòng)凱氏定氮儀檢定證書提供，儀器擴(kuò)展不確定度U儀器=1.4%,k=2，ur(儀器)=u儀器/kc=0.005 38。

2.1.3樣品稱量所用的電子天平示值引入的不確定度。經(jīng)查天平校準(zhǔn)證書，稱量樣品的電子天平最大允許誤差為±0.5 mg，重復(fù)性誤差為1.5 mg，四角誤差為±1.0 mg，按正態(tài)分布考慮，k=3，稱樣量的平均值為10.902 0 g，則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(m)=0.726 5 mg，ur(m)=u(m)/m=0.000 066 6。

2.1.5鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的不確定度。根據(jù)GB/T 601—2016進(jìn)行鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)定，其數(shù)學(xué)模型為

式中,CHCl為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mol/L);PNa2CO3為無水碳酸鈉的純度(%)；VHCl為滴定消耗的鹽酸體積(mL)；MNa2CO3為無水碳酸鈉的摩爾質(zhì)量(g/mol)。

不確定度傳播率為

ur(X)=

式中，rep為平行重復(fù)標(biāo)定的總重復(fù)性因子。

2.1.5.1標(biāo)定重復(fù)性引入的不確定度。表2為8次重復(fù)標(biāo)定的結(jié)果，按A類評(píng)定。

ur(rep)=0.000 400

表2 鹽酸標(biāo)定結(jié)果

2.1.5.2無水碳酸鈉基準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度。供應(yīng)商給出無水碳酸鈉基準(zhǔn)物質(zhì)純度P=99.98%，不確定度優(yōu)于0.05%，按B類評(píng)定正態(tài)分布，不確定度為u(PNa2CO3)=0.011 5%，ur(PNa2CO3)=u(PNa2CO3)/P=0.000 115。

2.1.5.3稱量無水碳酸鈉引入的不確定度ur(mNa2CO3)。經(jīng)查電子天平的校準(zhǔn)證書，該天平最大允許誤差為±0.5 mg，重復(fù)性誤差為1.5 mg，四角誤差為±1.0 mg，按正態(tài)分布考慮，k=3，稱樣量的平均值為0.201 32 g，則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(mNa2CO3)=0.623 6 mg，ur(mNa2CO3)=u(mNa2CO3)/mNa2CO3=0.003 10。

2.1.5.4無水碳酸鈉摩爾質(zhì)量M數(shù)值引入的不確定度。從最新的IUPAC原子量表，查得無水碳酸鈉各組成元素的原子量及其不確定度見表3。

表3無水碳酸鈉各組成元素的原子量及其不確定度

Table3Theatomicweightanduncertaintyofeachcomponentofanhydroussodiumcarbonate

組成元素Element原子量Atomicweightg/mol不確定度Uncertainty標(biāo)準(zhǔn)不確定度Standarduncertaintyg/molNa22．9898±0．00010．000060C12．0107±0．00080．000460O15．9994±0．00030．000170

u(MNa2CO3)=0.000 670 mg

MNa2CO3=105.988 5 g/mol

ur(MNa2CO3)=u(MNa2CO3)/MNa2CO3=0.000 006 30

2.1.5.5滴定基準(zhǔn)物質(zhì)消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積引入的不確定度。

(3)2種分量合成。u(VHCl)=0.030 0 mL，ur(VHCl)=0.000 828 mL。

2.1.5.6鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。ur(CHCl)=0.003 24。

2.2合成不確定度分量的計(jì)算及分析由上述可得到計(jì)算蛋白質(zhì)含量不確定度的有關(guān)量值。

根據(jù)公式(2)得到X的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur(X)=0.008 03，u(X)=0.010 4%。

對(duì)各影響蛋白質(zhì)含量的測(cè)定因素的分量進(jìn)行分析，從表4可以看出，儀器自動(dòng)滴定的體積對(duì)測(cè)定結(jié)果影響最大，占分量總和的34.94%，是影響測(cè)定結(jié)果不確定度來源的主要分量。其次是重復(fù)性試驗(yàn)、鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度以及數(shù)字修約的影響，樣品稱量所引入的不確定度是最弱小的，可以忽略不計(jì)。

表4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的分析

2.3擴(kuò)展不確定度取包含因子k=2(置信概率95%)，則U=2×u(X)=0.020 8%，蛋白質(zhì)含量為(1.30±0.03)%。

3 結(jié)論與討論

(1)影響樣品測(cè)定結(jié)果的不確定度分量很多，此次采用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定核桃花生奶中蛋白質(zhì)含量，其測(cè)量不確定度主要來源于儀器自動(dòng)滴定體積的不確定度，其次是檢測(cè)過程重復(fù)性試驗(yàn)的不確定度，即隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致的不確定度、鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的不確定度以及數(shù)字修約引入的不確定度。因此，儀器的先進(jìn)性成為減小合成不確定度的主要因素。

(2)從檢測(cè)過程重復(fù)性的不確定度即隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致的不確定度部分可以看出：重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度主要來源于樣品的稱量、消化及自動(dòng)蒸餾、滴定全過程的重復(fù)性試驗(yàn)，綜合上述的各分量所占比重，得出為減少重復(fù)性檢測(cè)所產(chǎn)生的不確定度，需要特別注意樣品消化、自動(dòng)蒸餾、滴定的過程。

(3)從鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的不確定度可以看出：主要來源于鹽酸標(biāo)定過程中滴定體積引入的不確定度，因此要特別注意在滴定過程中，準(zhǔn)確判定終點(diǎn)，以減少因此產(chǎn)生的不確定度。

[1] 黃奕娜，侯曉東，張樹潮，等.乳粉中蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果的不確定度評(píng)定[J].食品研究與開發(fā),2008,29(10)：98-100.

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[7] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).化學(xué)試劑 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備：GB/T 601—2016[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[8] 中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì),國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定：GB 5009.5—2016[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2017.