棘胸蛙虹彩病毒免疫方法研究

胡金春，胡靄臻，金米雪，林威丞，謝夢佳，包伊鵬，李 柯，鄭善堅*

(1.浙江師范大學野生動物保護與利用技術中心，浙江金華 321004；2.浙江省衢州市水產技術推廣站，浙江衢州 324002)

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)，又名石蛙，是我國棘蛙屬中分布最廣的物種之一，主要分布于我國云南、貴州、安徽、江蘇、浙江、江西、湖北、湖南、福建、廣東、廣西和香港等地區(qū)[1]。隨著人工養(yǎng)殖的發(fā)展，棘胸蛙病害也逐漸增多，近年來在浙江麗水等地區(qū)養(yǎng)殖的棘胸蛙出現(xiàn)了較為嚴重的蛙病，主要表現(xiàn)出體表腹部充血、頭部和四肢皮膚出現(xiàn)潰爛等癥狀，死亡率高達90%以上，常規(guī)用藥治療效果不明顯，嚴重制約了棘胸蛙的養(yǎng)殖發(fā)展。經鑒定，病原為虹彩病毒科(Iridovirus)蛙病毒屬(Ranavirus)的種類，暫命名為棘胸蛙虹彩病毒(QSIV)。

虹彩病毒是一類感染低等脊椎動物和無脊椎動物的二十面體狀、大型雙鏈DNA病毒，是水生動物重要的病毒性病原。蛙病毒最早于20世紀60年代從蝌蚪期的豹蛙(Ranapipiens)上分離[2]，目前蛙病毒感染呈世界性分布，包括北美、歐洲和亞洲，病毒宿主廣泛，有超過80種爬行動物和兩棲動物感染蛙病毒的報道，且大部分病毒對宿主有較強的致病性和致死性[3-7]。疫苗免疫被認為是防治蛙病毒等病毒性性疾病最安全、最有潛力的方法之一[8-9]。棘胸蛙膽小怕驚，捕捉及疫苗注射容易造成其應激性損傷及機械性損傷，體表噴霧免疫操作方便，對棘胸蛙的應激及損傷小，但上述2種免疫方法的免疫效果研究則鮮見報道。筆者對棘胸蛙虹彩病毒疫苗的不同免疫方法進行了研究，以期為棘胸蛙等兩棲蛙類開展疫苗免疫提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1材料棘胸蛙虹彩病毒QSIV由浙江省野生動物生物技術與保護利用重點實驗室分離；健康棘胸蛙，購自浙江綠谷清泉石蛙養(yǎng)殖合作社，平均規(guī)格(52.0±3.5)g；EPC細胞由浙江省淡水水產研究所提供；ELISA試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。

1.2疫苗制備選擇生長良好的鯉魚上皮瘤細胞(EPC細胞)，接種棘胸蛙虹彩病毒QSIV，23 ℃條件下培養(yǎng)，待細胞脫落75%以上時收集病毒，-20 ℃下保存。將所有制備的病毒液混合，采用Reed-Muench法計算病毒滴度[10]。將病毒液稀釋至1×108TCID50/mL，用0.1% β-丙內酯4 ℃下滅活72 h，制備疫苗。

1.3免疫試驗免疫前將棘胸蛙隨機均分為6組，每組20只，分別飼養(yǎng)在實驗室人工蛙槽中適應3 d。①、②、③組為注射組，分別肌肉注射0.2 mL 1×107TCID50/mL、1×108TCID50/mL的疫苗和等劑量的PBS。④、⑤、⑥組為噴霧組，用噴壺將濃度稀釋為1×107TCID50/mL的疫苗噴霧到棘胸蛙的體表皮膚，其中④組僅噴霧1次；⑤組每10 min噴霧1次，連續(xù)噴霧5次；⑥組噴灑純水，噴灑后10 min放回養(yǎng)殖槽。免疫后每隔7 d隨機取1只棘胸蛙心臟采血1次，共采血4次。將血樣先室溫靜置1 h，4 ℃冰箱中靜置24 h，3 000 r/min離心10 min，取上清用于血清抗體效價檢測。

1.4免疫效果評價

1.4.1血清抗體效價檢測。將疫苗12 000 r/min離心15 min，取上清用包被液稀釋，在 96孔酶標板各孔中加入稀釋過的抗原100 μL，37 ℃溫箱孵育2 h后，取出甩干各孔包被液，每孔加入封閉液100 μL，37 ℃孵育 1 h后甩干封閉液，用洗滌液洗板2次。將待測血清用洗滌液從1∶5倍比稀釋至1∶1 280，每個稀釋度8個重復，每孔加入100 μL不同稀釋度的血清，并設置洗滌液為空白對照。37 ℃培養(yǎng)箱溫浴1 h后洗板4次，在酶標板各孔加入1∶5 000稀釋的HRP標記羊抗兔 IgG 100 μL，37 ℃孵育，1 h后洗板5次，各孔加入 TMB 顯色液 100 μL，室溫避光靜置 10 min后，加入終止劑終止反應。在405 nm波長下，測定光密度值。按照以下公式計算P/N：P/N=檢測孔OD值/陰性孔OD值。若P/N>2.1則為陽性，若P/N<1.5則為陰性，介于二者之間為可疑。以出現(xiàn)陽性孔的最高稀釋度作為待檢血清效價[11-12]。

1.4.2相對免疫保護率檢測。免疫后35 d，選擇抗體效價較高的噴霧免疫組(將濃度稀釋為1×107TCID50/mL的疫苗每隔10 min進行1次體表噴霧，連續(xù)5次)和注射免疫組(0.2 mL 1×108TCID50/mL)進行攻毒試驗，另設置未經免疫的空白對照(CK)，每組6只棘胸蛙，分別肌肉注射0.2 mL的1×107TCID50/mL病毒液。攻毒后每天觀察并記錄感染發(fā)病與死亡情況，連續(xù)觀察21 d，計算相對免疫保護率。相對免疫保護率的計算公式[13]如下：相對免疫保護率=[1-免疫組死亡率/對照組死亡率]×100%。

2 結果與分析

2.1血清中和抗體效價檢測采用2種不同免疫方法對棘胸蛙接種疫苗后，14 d開始產生較高的抗體，其血清中和抗體效價與對照組相比有顯著升高(表1)。注射免疫組在21 d達到最高的抗體效價，注射0.2 mL 1×108TCID50/mL組的血清中和抗體效價達到380.2。噴霧免疫組出現(xiàn)最高抗體效價要比注射免疫組晚，噴霧免疫組在28 d出現(xiàn)最高抗體效價，其中⑤組的抗體效價達到320.0，即噴霧組需要更長的時間才能發(fā)揮較好的免疫作用。對照組的血清抗體效價都小于5。

表1棘胸蛙虹彩病毒免疫血清抗體效價

Table1SerumantibodytitersofiridescentvirusinQ.spinosaafterimmunization

組別Group免疫后天數(shù)Daysafterimmunization∥d17142128①<5．012．033．9190．5190．5②<5．017．087．2380．2320．0③<5．0<5．0<5．0<5．0<5．0④<5．08．547．9112．2160．0⑤<5．017．067．6158．5320．0⑥<5．0<5．0<5．0<5．0<5．0

2.2相對免疫保護率由表2可知，對照組第10天出現(xiàn)癥狀，第11天開始死亡，第21天總死亡率為83.3%。注射免疫組第21天總死亡率為16.7%，相對免疫保護率為80%；噴霧免疫組第21天的總死亡率為33.3%，相對免疫保護率為60%。注射免疫組效果較好，但噴霧免疫組也顯示出較好的免疫保護率。

表2 各組相對免疫保護效果

3 討論與結論

血清抗體水平的高低與動物機體的免疫保護效果有著密切的關系。采用注射和噴霧的免疫方法，棘胸蛙都產生了抗體，噴霧免疫和注射免疫都可作為棘胸蛙虹彩病毒疫苗的免疫途徑。其中注射0.2 mL 1×108TCID50/mL疫苗免疫組在21 d的血清中和抗體效價達到最高(380.2)，相對免疫保護率達到80%；⑤組在28 d的血清中和抗體效價達到最高(320.0)，相對免疫保護率為60%。注射免疫的免疫效果要好于噴霧免疫。與注射免疫相比，噴霧免疫需要更長的時間才能發(fā)揮較好的免疫保護作用。

目前，疫苗免疫主要采用注射免疫，噴霧免疫主要應用在禽類生產中，通過氣霧發(fā)生器將稀釋后的疫苗形成一定大小的霧化離子，均勻地懸浮于空氣中，隨呼吸進入家禽體內產生抗體[14]。棘胸蛙屬于兩棲動物，其可在陸地上生活，體表裸露，皮膚有豐富的微血管，采用噴霧免疫，可以利用體表皮膚及微血管吸收后進入體內產生抗體。該研究結果表明，棘胸蛙虹彩病毒疫苗采用噴霧免疫，可以產生有效的血清抗體效價和較高的免疫保護力，且操作簡便，對棘胸蛙不造成損傷。雖然其免疫效果不如注射免疫，但若結合免疫增強劑、體表高效滲透劑等相關研究，噴霧免疫將成為兩棲類動物的一種高效、便捷的無損傷免疫途徑，為蛙病疫苗的研究與使用提供良好前景。

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科技論文寫作規(guī)范——縮略語

采用國際上慣用的縮略語。如名詞術語DNA(脫氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)、ATP(三磷酸腺苷)、ABA(脫落酸)、ADP(二磷酸腺苷)、CK(對照)、CV(變異系數(shù))、CMS(細胞質雄性不育性)、IAA(吲哚乙酸)、LD(致死劑量)、NAR(凈同化率)、PMC(花粉母細胞)、LAI(葉面積指數(shù))、LSD(最小顯著差)、RGR(相對生長率)，單位名縮略語IRRI(國際水稻研究所)、FAO(聯(lián)合國糧農組織)等。對于文中有些需要臨時寫成縮寫的詞(如表及圖中由于篇幅關系以及文中經常出現(xiàn)的詞而寫起來又很長時)，則可取各主要詞首字母寫成縮寫，但需在第一次出現(xiàn)處寫出全稱，表及圖中則用注解形式在下方注明，以便讀者理解。