桑樹中色素的快速測定及其在品種和葉位間的差異分析

朱 琳， 郭 光， 范作卿， 王 娜， 鄒德慶

(山東省蠶業(yè)研究所，山東煙臺 264002)

高等植物的葉綠體色素可分為兩大類，即葉綠素類(主要有葉綠素a和葉綠素b)和類胡蘿卜素類(主要有β-胡蘿卜素和葉黃素)[1]。葉綠素廣泛存在于高等植物的葉果和藻類中，是植物葉綠體的重要組成成分，使大多數(shù)的葉類蔬菜和未成熟的果實呈現(xiàn)綠色[2]。葉綠素結(jié)構(gòu)與人類和大多數(shù)動物體血液中的紅色素結(jié)構(gòu)相似，從某種意義上講，它也是維持生命不可缺少的物質(zhì)。目前的研究表明，葉綠素具有改善便秘、降低膽固醇、抗衰老、排毒消炎脫臭、抗癌抗突變等功能[3]。β-胡蘿卜素是維生素A的前體，可在動物體內(nèi)能轉(zhuǎn)化為維生素，是動物體內(nèi)維生素A的主要來源。另外，類胡蘿卜素對動物的繁殖機能有獨特作用，類胡蘿卜素是一種生理抗氧化劑，可保護卵泡和子宮細胞免受氧化反應(yīng)的破壞，有助于卵巢內(nèi)類固醇的合成，改善子宮內(nèi)環(huán)境[4-5]。

桑樹(MorusalbaL.)葉甘寒無毒，有潤肺、平肝、明目等功效，可除寒熱，出汗(漢《神農(nóng)本草經(jīng)》)，多用于外感風(fēng)熱引起的發(fā)熱、咳嗽、頭痛、目赤等癥；桑枝和桑白皮分別取自桑樹的嫩莖和根皮，均有利水、消腫的作用，可治療尿少、浮腫等癥。最新研究表明，桑葉不僅具有多種營養(yǎng)性功能成分，還有多種多樣的生物活性和藥理作用，包括降血糖[6]、延緩衰老、抗氧化[7]、抗凝血[8]、抗癌[9]等功能。目前關(guān)于桑葉和桑枝皮中葉綠體色素的研究還比較少，大部分還是集中在桑葉葉綠素提取工藝的優(yōu)化和桑枝條的綜合利用等方面。鄧祥元等通過采用有機溶劑萃取法和分光光度法對桑葉葉綠素進行提取與含量測定，通過比較不同節(jié)位桑葉及桑葉不同部位的葉綠素含量，分析桑葉葉綠素的光譜特征及其含量的變化規(guī)律；通過比較不同溶劑及其濃度(體積)、不同萃取時間對萃取效率的影響，初步獲得桑葉葉綠素的萃取工藝；并且研究表明，葉綠素易溶于無水乙醇、丙酮等有機溶劑，而在乙酸乙酯中的溶解度則較低；且丙酮與無水乙醇的混合使用可顯著提高葉綠素的萃取效率[10-11]。陳紹瑗等在前人研究的基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化桑葉葉綠素的提取工藝，結(jié)果表明，桑葉葉綠素提取的最佳工藝參數(shù)為：提取時間5.25 h，提取溫度56.5 ℃，液料比 103 mL ∶1 g[12]。另外有研究表明，桑枝皮醇提物具有很強的α-葡萄糖苷酶抑制作用[13-14]和降血脂等多種藥理作用[15]。在桑枝皮藥理成分的提取加工過程中發(fā)現(xiàn)，有相當(dāng)數(shù)量的脂溶性物質(zhì)還沒有得到充分利用，這些物質(zhì)大多屬于可見色素如葉綠素和類胡蘿卜素等。眾所周知，葉綠素、類胡蘿卜素等2類色素具有許多生物活性和藥理作用。但是，對于桑葉和桑枝條皮層中這些色素的含量及其在不同葉位或桑樹品種間的差異等研究報道甚少。

高效液相色譜(HPLC)是分析脂溶性色素如葉綠素和胡蘿卜素的常用技術(shù)[16]，被廣泛應(yīng)用于各種浮游植物以及水果和蔬菜色素的檢測中[17-19]。

因此，本研究采用反相高效液相色譜和二級管陣檢測法(RP-HPLC-DAD)對桑樹中的色素進行快速分離、測定，以期為更好地開發(fā)和利用桑樹資源特別是桑葉和桑枝條資源提供可靠的分析依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑和儀器

10個桑樹品種分別為湖桑32、花桑、白格魯、沙二、延邊秋雨、湖北荊桑、農(nóng)桑8號、皺皮荷葉、皮桑和紅皮毛桑。各品種的桑葉與1年生桑枝條均于夏秋季節(jié)采自山東省蠶業(yè)研究所的桑園。采集相同葉位的葉片，每個葉位采集3～4張，每個品種的桑枝條采集3～5根。湖桑32桑葉不同葉位中色素含量的研究，采取隔位采摘的方法采葉，即從上到下，從嫩葉到老葉，從第1位、第3位、第5位…第17葉位，共采摘9個不同葉位的桑葉樣品。用剝皮機對桑枝條進行皮層與木質(zhì)部分離，然后把所有桑葉及桑枝皮進行凍干處理，凍干樣品用JFSD-100粉碎機反復(fù)粉碎制成粉末，備用。

標(biāo)準(zhǔn)品葉黃素購自上海融樂醫(yī)藥科技有限公司，紫黃質(zhì)購自CaroteNature公司，β-胡蘿卜素與葉綠素a購自日本和光純藥工業(yè)株式會社，葉綠素b購自B & K科技(中國)有限公司。

高效液相色譜系統(tǒng)：島津LC-20A HPLC系統(tǒng)，包括自動進樣器、高壓輸液泵，二級管陳列檢測器；檢測波長為 440 nm；掃描波長范圍200～800 nm。

1.2 色素分離提取方法

取桑葉或桑枝皮的凍干粉末在黑暗避光的條件下用丙酮研磨3次，合并過濾液，以1萬 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，最后取上清進行高效液相色譜分析，每個樣品重復(fù)3次。

1.3 色素含量測定

HPLC檢測：采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離和二級管陳列檢測器(DAD)檢測色素，具體方法如下[20]。

色譜條件：色譜柱為C18VP-ODS色譜柱(SHIMADZU 250 4.6 mm)，流動相A為80%的甲醇；流動相B為乙酸乙酯。流速1 mL/min，檢測波長440 nm，DAD掃描范圍200～800 nm。梯度洗脫條件為：0～2.5 min，B濃度由20%上升到22.5%；2.5～17.5 min，B的濃度由22.5%升到50.0%；17.5～20.0 min，B濃度維持在50%；20～21.5 min，B的濃度上升為80%；21.5～23.5 min，B的濃度維持在80%；23.5～28.5 min，B的濃度上升為100%；28.5～40 min，B的濃度維持在100%。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

測定的數(shù)據(jù)運用Origin 8.5軟件進行分析，試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種色素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)樣品用丙酮溶解，配制成一定濃度的母液，于4 ℃冷凍保存待測。檢測時取4種色素標(biāo)準(zhǔn)樣品母液配制成混合標(biāo)樣進行HPLC-DAD分析，其進樣量分別為2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μL，每個梯度重復(fù)3次。圖1為4種標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖和200～800 nm可見紫外光譜掃描圖。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為y軸，色譜峰面積為x軸，用Origin 8.5軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出各標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度與吸光度相關(guān)性的線性方程與相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如圖2所示。

經(jīng)回歸分析，葉黃素(lutein)標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程是y=56 151.173 24+5.156 630x，相關(guān)系數(shù)r=0.999 29；葉綠素b的回歸方程是y=116 499.793 51+4 568 980x，相關(guān)系數(shù)r=0.995 16；葉綠素a的回歸方程是y=63 998.968 98+5 479 630x，相關(guān)系數(shù)r=0.996 47；β-胡蘿卜素(β-carotene)標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程是y=-23 659.399 23+5.236 250x，相關(guān)系數(shù)r=0.998 94。從圖2可以看出，各色素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度與光吸收的色譜峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(線性范圍為0.062 5～1.0 μg)。

2.2 不同葉位桑葉中葉綠體色素的組成與含量

同一桑樹品種(湖桑32)不同葉位桑葉樣品中葉綠體色素的HPLC-DAD反相色譜(圖3)都含有4個主要色譜峰，以標(biāo)準(zhǔn)樣品作對照，這4個峰的保留時間和其紫外可見吸收光譜按出峰時間順序分別為葉黃素(RT=17.6 min)、葉綠素b(RT=26.5 min)、葉綠素a(RT=27.5 min)和β-胡蘿卜素(RT=30.2 min)。

將色譜圖中各個色譜峰的峰面積代入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程中得到各樣品中各種色素的含量。由圖4可知，9個葉位的桑葉樣品從嫩葉到老葉編號為第1位至第17位，不論夏季桑葉是嫩葉還是老葉，其葉黃素和β-胡蘿卜素的含量都高于葉綠素a和葉綠素b。隨葉位的升高，β-胡蘿卜素含量、葉綠素a和葉綠素b含量整體上都呈先升高后降低的變化趨勢，β-胡蘿卜素、葉綠素b在第7位成熟葉中的含量最高，分別為254.06、117.66 μg/g；葉綠素a在第11位成熟葉中的含量最高，為78.77 μg/g。而葉黃素的變化規(guī)律有些不同，呈先升高后降低然后又再升高的變化趨勢，并最終在老葉中積累。葉綠素a含量與葉綠素b含量的變化為第1位至5位至第11葉位，葉綠素a含量與葉綠素b含量的比值先減小后增大，11葉位以后葉片逐漸變黃，葉綠素a的比例也明顯升高，最后達到葉綠素b的3倍左右。葉黃素含量和β-胡蘿卜素含量的比值除了第7葉位小于1外，其他都大于1且隨著葉位的升高而增加。

上述結(jié)果表明，隨著葉片的成熟，葉黃素成為衰老葉片中積累量最多的色素，但就葉黃素本身的含量而言，并沒有發(fā)生很大的變化，特別是在衰老葉片中，其含量沒有明顯提高；β-胡蘿卜素在衰老過程中變化最明顯，先升高成熟后又逐漸降低，最后降到和葉綠素含量相當(dāng)?shù)乃健θ~綠素來說，最后葉綠素a的含量可達葉綠素b的3倍。

2.3 桑葉與桑枝皮中葉綠體色素含量在品種間的差異

2.3.1 各種色素含量的差異 10個供試品種相同葉位(第 5位至第7葉位)的桑葉及桑枝皮凍干粉樣品，用“1.2”節(jié)中的方法抽提樣品中的可見色素并進行HPLC-DAD分析。不同品種的桑葉和桑枝皮中4種色素的含量各不相同(表1)，其中除紅皮毛桑外的9個桑樹品種桑葉中的4種色素均以葉黃素含量為最高，最高可達到446.12 μg/g；均以葉綠素a的含量最低，只有24.75 μg/g；而紅皮毛桑桑葉中的葉綠素a含量最高，為212.85 μg/g。10個品種桑枝皮中葉黃素和葉綠素a等2種色素所占的比例較高，葉綠素b含量不穩(wěn)定，在桑樹品種花桑、白格魯、紅皮毛桑的樣品中幾乎檢測不到。

表1 不同桑品種桑葉和桑枝皮中4種色素的含量

注：“—”表示該成分未被檢測到。

2.3.2 色素總量的差異 如圖5所示，各個品種桑葉和桑枝皮中的4種色素總量存在比較明顯的差異：紅皮毛桑葉片中4種色素含量為400 μg/g左右，而湖桑32葉片中4種色素總量約是前者的2.7倍，達到1 100 μg/g以上。桑枝皮中，品種間4種色素的總量差異也較明顯，其中沙二4種色素占樣品的質(zhì)量比最高，為190.20 μg/g，而皮桑中含量最低，為59.97 μg/g。

2.4 桑葉與桑枝皮中4種色素總含量的比較

10個供試桑品種的桑枝皮中，4種色素總含量(與樣品的質(zhì)量比)平均在100 μg/g左右，而桑葉中4種色素總含量的平均值約為800 μg/g，桑枝條皮層中4種色素的總含量可達到桑葉的1/8。所以，從廢棄的桑枝條皮層中或從桑枝皮加工廢料中提取或回收脂溶性的葉綠素和類胡蘿卜素特別是葉黃素是具有一定可行性的，此外這還與提取分離工藝、成本、效益等有關(guān)，所以需要進一步的研究證明。

3 討論與結(jié)論

本研究采用高效液相色譜法和二極管陣列檢測器對桑葉和桑枝條皮層(簡稱桑枝皮)中的色素種類及其含量進行分離、鑒定和分析。同一品種(湖桑32)不同葉位的桑葉，無論是嫩葉還是老葉中的類胡蘿卜素(葉黃素和β-胡蘿卜素)含量都高于葉綠素a和葉綠素b，就其中單一色素含量的變化而言，β-胡蘿卜素、葉綠素a和葉綠素b的含量整體上都隨葉位的升高呈先升高后降低的變化趨勢，最高值分別出現(xiàn)在成熟葉片第7、第11、第7位樣品，β-胡蘿卜素最高為 254.06 μg/g，葉綠素a為78.77 μg/g，葉綠素b為 117.66 μg/g；而葉黃素則是先升高后降低，最后又升高，最終在老葉中積累。由此可以說明，β-胡蘿卜素、葉綠素a和葉綠素b在桑樹不同葉位桑葉中含量的變化與桑葉成長過程基本保持一致，在成熟的壯年期含量達到最高，但隨著葉片的逐漸衰老含量也隨之下降并在最后達到最低值。葉黃素含量的變化在幼年期和壯年期也隨葉位的升高而呈先升高后降低的變化趨勢，但到老年期卻又升高甚至高于幼年期的含量，可能是由于葉片在老年期時，其他類胡蘿卜素轉(zhuǎn)變成了葉黃素從而產(chǎn)生了這種現(xiàn)象。不同桑樹品種桑葉和桑枝皮中色素總量的比較分析結(jié)果表明，不同品種桑葉和桑枝皮中的色素含量差異較大，可能是桑樹自身基因、生長環(huán)境等多種因素共同作用的結(jié)果。桑枝皮中色素的平均總含量在100 μg/g左右，而桑葉中的色素總量為800 μg/g左右，桑枝皮中色素總量可達到桑葉的1/8。所以，從廢棄的桑枝條皮層中或從桑枝皮加工廢料中提取或回收脂溶性的葉綠素和類胡蘿卜素特別是葉黃素是切實可行的。

高效液相色譜法雖具有應(yīng)用范圍廣的優(yōu)點，但也存在一定的局限性，如僅以保留時間定性和以峰面積定量可能會產(chǎn)生誤差；但其具有靈敏度高、選擇性強、分析速度快等優(yōu)點，且流出的組分容易收集，操作自動化，使用安全，經(jīng)過多次重復(fù)試驗，能夠盡可能縮小誤差的產(chǎn)生。本研究的測定方法和試驗結(jié)果可為今后更好地開發(fā)和利用桑樹資源特別是桑樹枝條皮層中的可見色素提供重要的試驗數(shù)據(jù)。

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