HPLC-TOF/MS法檢測黃曲霉毒素及霉菌指紋譜圖的建立

李志賢， 郭禮強， 孫清榮， 李 楠

(1.山東科技職業學院，山東濰坊 261053； 2.濰坊出入境檢驗檢疫局，山東濰坊 261041)

霉菌的鑒定和分類在傳統上以形態和培養特征為主要依據，但霉菌的形態特征復雜，其形態研究也因沒有標準、共同的表述及具有較大的人為主觀性而經常受到質疑[1]。分子生物學是解決以上問題的有效途徑之一，然而許多分子技術手段仍處于研究階段，只能部分取代常規的霉菌鑒定方法，作為用于形態學鑒定的一個有力補充，此外利用分子生物學手段進行真菌的分類和鑒別在時間和金錢方面花費較多，這是其最大短板。次生代謝產物是在霉菌正常生長受抑制時才會大量產生的，由于霉菌代謝產物有一定的特異性[2]，通過其代謝產物，可以對其進行一定的劃分，作為形態學和分子生物學分類的補充。

霉菌的存在是產生霉菌毒素的先決條件，但有霉菌污染并不一定會帶來霉菌毒素污染，二者存在緊密且必然的聯系，比如黃曲霉有產霉毒素的菌株和不產霉毒素的菌株，不產毒素菌株被用來作為有益菌對產毒菌株加以抑制，但二者從分類學和分子生物學的角度比較，差異非常小，而如果從食品安全角度比較，產毒與不產毒菌株完全是兩個概念。霉菌代謝產物在一定條件下也可以相互進行轉化，近年來國外有研究表明，雜色曲霉毒素在合適條件下可以轉化成黃曲霉毒素。目前，霉菌的檢測和分類與真菌毒素的檢測從生物學和化學的兩個領域被嚴格區分開來，各自被獨立進行研究，忽視了其內在的必然聯系和規律。Minto等報道，黃曲霉毒素其中一條合成途徑后部分為雜色曲霉素A→脫甲基雜色曲霉素→雜色曲霉素(ST)→O甲基雜色曲霉素(MST)→黃曲霉毒素B1(AFB1)[3]。本研究通過高分辨質譜檢測到ST和MST毒素，而對于其前體脫甲基雜色曲霉素和雜色曲霉素A未檢測到，推測這2種次級代謝物含量很少或為非胞外代謝物。過去，直接分析真菌培養基以確定是否存在霉菌毒素必然包括“目標”分析，不可避免地假定能找到那種毒素，而高分辨質譜提供了一種可能的新方法用于研究真菌產生毒素的行為，因為儀器能測定在液相色譜分離中檢測到的任何組分分子、離子的精確質量數，這些組分可以通過檢索數據庫中相關次級代謝產物的精確質量數得以鑒定，在全掃描條件下具有靈敏度高和選擇性好的特點，適用于多種代謝物的同時檢測[4-6]。目前，國內外缺乏利用高分辨質譜法對霉菌代謝產物進行的研究，筆者所在課題組通過代謝產物提取培養，經高分辨質譜檢測篩查，通過代謝譜庫搜索，尋找其生物性標志物并建立其指紋圖譜，對產毒曲霉有毒代謝物篩選和菌種類鑒定提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

高效液相色譜-高分辨質譜聯用儀：Thermo Ultimate 3000-Exactive(美國Thermo公司)，配電噴霧離子源(ESI)；離心機：5810R型(Eppendorf公司)；氮吹儀：N-EVAP(Organomation Associates公司)；霉菌培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；高溫蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；純水機：Milli-Q(美國Millipore公司)；萬分之一天平(Mettler AE163)；均質器(IKA T25)；振蕩器(IKA MS1)；5 mL一次性注射器； 0.22 μm 針頭過濾器。

AFB1、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2)、青霉酸、曲酸均購于Biopure公司；ST、MST購于Sigma公司中性氧化鋁(Alumina-N)購于上海五四化學試劑有限公司；石墨炭黑粉(GCB)、C18粉(ODS)、PSA粉和氨丙基粉(Cleanert NH2)購于Agela Technologies Inc。

甲醇、乙酸乙酯、乙腈和甲酸均為色譜純，美國Biopure公司；PD液體培養基(霉菌培養基)：馬鈴薯去皮切塊，每 200 g 加入500 mL水，煮沸30 min。雙層紗布過濾至燒瓶中，加入20 g蔗糖，加水至1 L，121 ℃高壓滅菌20 min。

標準菌株：寄生曲霉(CGMCC3.124)，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

1.2 樣品處理

將冷藏菌種接種到PD液體培養基內，28 ℃培養5 d，取培養液400 μL接種到裝有10 mL PD液體培養基的培養皿中，在28 ℃下培養9 d。使用移液器移取菌液3 mL到離心管中，13 000 r/min離心10 min，吸取上清液2 mL到干凈玻璃管中；加入6 mL乙腈(含1%甲酸)溶液，渦混均勻后于30 ℃水浴氮氣吹干，在玻璃管中加入0.2 g ODS，用1 mL乙腈-水(3 ∶7，含0.1%甲酸)渦混定容，靜置1 min后取上清液經 0.22 μm 的濾膜過濾，待上機分析。同時以空白PDA培養基重復以上方法作對照。

1.3 液相色譜串聯質譜條件

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱：Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相A：水-甲醇-甲酸(體積比 900 ∶99 ∶1)加5 mmol乙酸銨；流動相B：甲醇-甲酸(體積比999 ∶1)。高效液相色譜(HPLC)使用反相C18柱，流動相：A 0.1%甲酸水，B甲醇。梯度洗脫程序：0.0 min→1.0 min，5% B；1.0 min→6.0 min，5% B→30% B；6.0 min→11.0 min，30% B→60% B；11.0 min→16.0 min，60% B→98% B；16.0 min→18.0 min，98% B；平衡2.0 min。進樣體積10 μL，流速 0.3 mL/min。

1.3.2 質譜條件 全掃描正離子模式，氣體溫度為350 ℃，干燥器流量為12 L/min，霧化器壓力為310.264 kPa，離子源為正離子，數據儲存方式為柱狀圖，質量掃描范圍(m/z)為100～1 100。標準品參數見表1。

表1 8種真菌毒素標準品的參數

1.4 數據處理

數據采用XCMS開放性軟件進行色譜峰識別以及峰匹配，并采用主成分分析法(pnhcipal component analysis，簡稱PCA)對對照組和培養提取液組進行模式識別。

2 結果與分析

2.1 提取條件的選擇

用于提取溶液中目標組分的試劑一般為乙酸乙酯和異丙醇，本試驗通過在空白培養基中添加目標物提取后經質譜檢測的方法分別對乙酸乙酯、乙酸乙酯+異丙醇、乙酸乙酯+1%甲酸、乙酸乙酯+異丙醇+1%甲酸和乙腈+1%甲酸的提取效果進行考察，結果發現MST回收率偏低，不適用于乙酸乙酯等有機溶劑提取(表2)。通過多次試驗，最終選擇了乙腈+1%甲酸提取，各種代謝物的提取回收率均達到了86%以上，結果見表2。

2.2 凈化條件的選擇

培養基基質復雜，而常用的免疫親和柱和多功能凈化柱受真菌毒素化學性質限制，通過基質加標的方法分別比較了226(Romer)、HLB(Waters)、Agilent多功能凈化柱、黃曲霉免疫親和柱(華安麥科)對真菌毒素或代謝物的回收率。結果表明，黃曲霉免疫親和柱只對黃曲霉類有較好的回收，HLB固相萃取柱對真菌毒素及代謝物有較高的回收率，但凈化成本很高，見表3。本研究使用QuEChERS方法[7-8]，同時考察了Alumina-N、GCB、ODS、PSA、NH25種凈化粉對6種霉菌代謝物毒素的吸附回收率，通過標準品加凈化粉經質譜檢測并計算回收率，結果發現ODS凈化回收率在91.3%～108.9%，凈化粉回收率較好，而其他凈化粉對6種毒素都有不同程度的吸附，結果見表4。通過對ODS凈化粉不同添加比例組合后凈化8種真菌代謝物的對比，確定了“1.2”節用量為最佳比例條件。

2.3 色譜質譜條件的優化

2.3.1 色譜條件的選擇 采用1.8 μm色譜柱填料使得高效液相色譜在較高的流速下依然可以保持良好的分離效率，并節省分析時間，提高分析通量?？紤]到質譜系統對流量的耐受性，采用0.3 mL/min的流速能夠滿足分離要求并提高分析通量，同時可不經分流將流出液直接導入質譜系統進行檢測。對于培養基這種復雜的霉菌代謝物樣本，等度洗脫很難達到滿意的效果，而梯度洗脫是一種較為理想的選擇。在試驗中筆者采用空白基質同法制備的樣品來考察梯度條件對于分離的影響。首先，采用線性梯度洗脫，即B液在10 min內由0%線性變為98%(10 min后為柱沖洗和柱平衡程序)，雖然超高效液相色譜(UPLC)有相對于HPLC更高的分離效率，但由于培養液中化合物的種類和數量都非常多，分離效果達不到要求。將梯度洗脫時間延長為20 min，分離情況以及檢測到峰的數量都有明顯的提高。進一步將洗脫時間延長為30 min，分離效果又有了提高，但17 min后色譜峰較少，可以進行進一步的優化以縮短分析時間，通過梯度程序進一步優化將洗脫時間變為18 min，平衡2 min，用于霉菌代謝物的分離分析，取得了較為理想的分離效果。良好的分離可以進一步減少質譜檢測的離子抑制效應。

表2 不同提取試劑的提取效率 %

表3 不同凈化柱對多種代謝物回收率的影響 %

注：“NF”表示未檢測到。

表4 經ODS、Alumina-N、GCB、PSA、NH2吸附 的8種真菌毒素回收率 %

對于培養基這種復雜體系而言，其掃描的色譜峰的數量非常多，若分析色譜保留時間的穩定性差，直接對比空白樣品和培養液代謝物指紋圖譜來觀察代謝物的變化比較困難。采用開放性軟件XCMS可以快速提取出有用的信息。模式識別的方法有賴于高質量的數據集的建立，即色譜峰的匹配。保留時間的恒定對于色譜峰的匹配是至關重要的因素。本試驗考察了標準品中6個色譜峰在3次重復分析中保留時間的穩定性，結果顯示色譜保留時間的穩定性較好。

任何代謝物的產生，在霉菌代謝合成中都有一個代謝途徑，也可能有旁路途徑或分支途徑，比如在黃曲霉毒素代謝中，雜色曲霉素B可以合成黃曲霉毒素B2，也可以氧化進一步合成黃曲霉毒素B1；黃曲霉毒素G2和黃曲霉毒素B2a為同分異構體，黃曲霉醇和黃曲霉B2為同分異構體，黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素Q1為同分異構體等，還有其他一些未知的代謝物，結構和化學性質類似，要實現良好分離比較困難。試驗發現，流動相為甲醇-水時(含0.1%甲酸)，有的峰形不好，分離度達不到要求。對甲醇-水流動相進一步調整，經反復試驗，確定了前面所述流動相比例以及梯度洗脫方法，應用該方法基線平穩，各成分能完全分離并得到好的響應值。高分辨質譜儀不需要對質譜條件進行特殊優化，可以采用通用質譜條件，只需調整掃描質量范圍即可。化合物篩選離子提取誤差小于5×10-6u。提取離子色譜圖見圖1、圖2。

2.3.2 質譜條件的選擇 對于質譜離子源，需要設置干燥氣的溫度、流量，霧化器的壓力，以及毛細管電壓等參數的數值。其中干燥氣的溫度、流速，霧化器的壓力還與流動相的比例、流速以及待分析的物質有很大關系。本試驗中對培養產毒霉菌的研究，是以產黃曲霉毒素為基礎的，根據黃曲霉毒素建立霉菌代謝產物標志代謝產物及其指紋圖譜，不是檢測和建立其所有標志性代謝產物，由于黃曲霉毒素在正離子條件下響應值高，所以只是做了正離子全掃描，并且能得到很多的化合物信息，質荷比范圍為100～1 100，減少了分析時間，所以本試驗選用正離子掃描。脫溶劑氣流量以及溫度對代謝物的離子化效率有較大影響。以0.3 mL/min的流速泵入0.1%甲酸溶液，調整霧化氣流量以及溫度，觀察霧化情況，結果在脫溶劑氣流量為12 L/min、溫度為350 ℃的情況下噴霧效果較好并且穩定。Q-Tof質譜儀采用微通道板來檢測離子，增加微通道板電壓可以提高信號強度，同時也會影響其使用壽命。采用恒流泵恒速泵入參比溶液，以100 V為單位從1 800 V開始逐步增加電壓，觀察m/z=322.048 1的峰的強度，直至增加100 V電壓時峰強度的增加幅度低于30%即為最優電壓。通過優化得到的微通道板電壓為2 500 V。

2.4 標準品掃描分析

代謝組學的核心問題是通過一個對照組和試驗組的等比性分析，比如用霉菌培養后純化的培養液作為試驗組，用空白培養基作同等處理后作為對照組，通過它們之間的等比對照分析，去解釋它們之間的一些代謝物和代謝通路的差別，通過對代謝組的整體性分析，將這些代謝物產物與生物學特征、功能和疾病等相互關聯在一起。為便于分析研究，首先配制各濃度均為5 μg/mL的混合標準溶液經高分辨質譜掃描檢測，為保證數據的穩定性和利于數據分析處理，標準品和空白樣品各掃描3次，保存模式為柱狀圖模式(Centroid)。用Metabolomics XCMS開放性軟件處理，根據空白對照、精確分子量以及一定的統計學分析如P值<0.05等來減少雜質分子的干擾，確定標準品參數，結果見表5。表5中的數據，是標準品和空白樣品經高分辨質譜掃描，經XCMS軟件處理比對的結果。差異分3種情況，一種是標準品有而樣品沒有，即標準品經質譜掃描在特定位置出峰而空白樣品因沒有其化合物，則在同樣時間不會出現與標準品一樣精確分子量的化合物峰；二是標準品和空白樣品在特定位置同時出峰；三是標準品在特定時間未出峰而空白樣品有顯著峰。根據標準品和空白樣品的差異變化我們可以把差異的后2種情況排除，從而快速得到標準品的特征性參數。通過表5中標準品化合物理論m/z與實際測量值相比較，偏差范圍不超過5×10-6u。應用XCMS軟件的優點是不需要人工對每個特征峰提取，經軟件處理即可得到所有的特征峰參數，在樣品比對中會極大地節約時間，通過標準品和空白樣品的比對，筆者可以確定方法的可行性，并可通過綜合掃描情況對其進行整體分析。

2.4.1 總離子流圖比較 總離子流圖對比效果見圖2。

2.4.2 離子云圖比較 在試驗比對中，通過XCMS軟件中的離子云(Cloud Plot)可以形象化一個二維數據集的分布，當在有非常多的數據集合時對比明顯，使用內置的例程在圖中軸線設置限制，并添加各點的數據，如圖3上半部分為空白樣品的Cloud Plot，橫坐標為時間軸，縱坐標為質核比，綠色圓點為每個特異性離子。圖3下半部分標準品的Cloud Plot，可以很簡單明了地弄清楚空白樣品和標準品的差異。

表5 標準品掃描比對結果

2.4.3 主成分分析 主成分分析或者主元分析，是一種掌握事物主要矛盾的統計分析方法，它可以從多元事物中解析出主要影響因素，揭示事物的本質，簡化復雜的問題。計算主成分的目的是將高維數據投影到較低維空間。對于一個由多個變量描述的復雜事物，人們難以認識，如果事物的主要方面剛好體現在幾個主要變量上，人們只需要將這幾個變量分離出來，進行詳細分析，PCA是可以用原有變量的線性組合來表示事物的主要方面的分析方法。本試驗通過PCA圖譜分析，確定比對結果差異明顯，詳見圖4。

2.5 樣品掃描分析

基于液相色譜串連質譜的非靶向代謝組學的研究流程一般分為3個部分：一是樣品準備和數據采集；二是數據處理工具，本試驗用XCMS數據處理；三是代謝物結構鑒定。代謝組學目前主要應用于早期疾病的診斷，如糖尿病診斷，以及發現疾病的代謝途徑、代謝通路、了解疾病的發生發展。本試驗主要通過靶向代謝和非靶向代謝結合的方法，通過預測可能的代謝產物來對霉菌產毒代謝物的研究，了解其標志性代謝物的產生及發展。按照“1.2”節樣品處理方法將樣品CGMCC 3.124經Metabolomics XCMS開放性軟件處理，根據空白對照、精確分子量和出峰時間等篩選CGMCC 3.124代謝產物的同時確定其菌種的指紋譜圖，并經過標準品確定，結果見表6。

表6 樣品3.124掃描比對結果

表7 METLIN數據庫檢索精確分子量347.076 4化合物及結構特征

3 討論

霉菌代謝物眾多，對于非靶向代謝來說，只通過有限的標準品來判定比較困難，又由于二次代謝物產量少，代謝物基質復雜，目前沒有非常有效的提取純化方法，從而制約了通過高分辨質譜二級離子掃描來篩查化合物。本試驗通過大量的基礎資料收集以及文獻資料檢索，先確定黃曲霉毒素代謝物的產生途徑及各種可能的代謝產物，有針對性地對代謝產物進一步篩選，從而通過精確分子量搜索代謝物數據庫初步對化合物分子式和名稱進行推測判定。比如篩查中提取到代謝物精確分子量347.076 4，通過代謝物譜庫搜索到6種可能的代謝物(表7)，結構式推斷為C17H14O8，推測為黃曲霉毒素M2(AFGM2)、黃曲霉毒素G2a(AFG2a)或黃曲霉毒素B1二醇中的一種，由于代謝物含量很低，需要進一步優化培養條件和提高凈化方法來進一步判定。

4 結論

本研究建立了一種產毒霉菌代謝物指紋譜庫的快速檢測方法，借助高分辨質譜設備和代謝軟件以及代謝物譜庫，篩查霉菌有毒性標志物并建立其指紋譜圖，可為霉菌分類提供一定的補充，為篩查未知化合物提供一定的參考。

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