晝夜變化對廣藿香中揮發油及其主要成分積累的影響

劉 璐， 吳友根， 張軍鋒， 于 靖

(海南大學園藝園林學院，海南海口 570228)

廣藿香[Pogostemoncablin(Blanco) Benth.]為唇形科刺蕊草屬植物，原產于菲律賓、馬來西亞等國，梁代或之前傳入我國[1]，現主要分布于海南和廣東2省，廣東肇慶、廣州、湛江以及海南萬寧等地均有栽培，同時福建、廣西和臺灣等地也有少量種植。廣藿香以其干燥地上部分入藥，是我國常用的芳香化濕類中藥，其味辛，性微溫，歸脾、胃、肺，具有芳香化濁、開胃止嘔、發表解暑之功效。主要用于濕濁中阻、暑濕倦怠、胸悶不舒、寒濕閉暑、腹痛腹瀉、鼻淵頭痛的治療[2]，現已是藿香正氣水(片、丸、口服液)、抗病毒口服液等30多種中成藥的主要原料[1]。此外，在2003年防治非典型性肺炎期間，以廣藿香為主要藥效成分的藿香正氣水、藿香正氣軟膠囊等系列產品在全國各地暢銷，對預防非典具有良好的效果，為廣藿香新產品的開發創造了良好的市場契機，發展前景非常廣闊。除藥用外，廣藿香還是重要的芳香植物，從該植物中提取的廣藿香油在日用品及化工行業中得到廣泛應用，可用作化妝品、定香劑、殺蟲劑等的生產配料[3]。

廣藿香油被認為是廣藿香的主要藥用成分[4-5]，一直是人們研究的焦點。20世紀70年代，學者首次從廣藿香油中分離得到具有抗真菌生物活性的廣藿香酮[6]。近年來，隨著氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)技術的普及，廣藿香揮發性成分的分析變得快捷簡便，出現了較多的分析報道。

研究表明，倍半萜合酶基因的表達受生物鐘調節，通常以日為周期，基因的表達量和產物呈午后高而夜間低的變化規律，分析成熟廣藿香在1 d內不同時間點揮發油及其主要成分含量的變化，對于確定廣藿香藥材的最佳采收時間具有十分重要的意義[7]。為此，本試驗采用GC-MS技術分析成熟廣藿香在晝夜變化過程中揮發油及其主要成分的含量變化，以期為廣藿香揮發油及其主要成分的積累機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

本試驗所用成熟廣藿香材料，均取自海南大學園藝園林學院廣藿香資源圃。

為探討廣藿香中百秋李醇等的含量是否受晝夜變化的影響，在廣藿香成熟期某天24 h內的8個時間點(09：00、12：00、15：00、18：00、21：00、00：00、03：00和06：00，每隔3 h采樣1次)采集各成熟廣藿香地上部分，并進行低溫干燥處理，用于提取廣藿香油，分析其中百秋李醇等的含量差異。

所用儀器為HP6890/597型氣相色譜/質譜聯用儀(美國)。

1.2 試驗方法

1.2.1 揮發油提取 將廣藿香地上部分材料陰干后用打粉機磨碎，采用水蒸氣蒸餾法[8]提取揮發油。稱取100 g粉末，加7倍體積的水浸泡5 h，提取4 h后用無水硫酸鈉干燥，于 0 ℃密封避光保存，備用。

1.2.2 GC-MS分析條件 氣相色譜條件：色譜柱為HP-Intiowax Polyethylene Glycol彈性石英毛細管柱(柱長30 m，內徑0.32 mm，膜厚度0.25 μm)，柱溫50 ℃，以6 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min，汽化室溫度為250 ℃。載氣為髙純氦氣(99.999%)，柱前壓52.5 kPa，載氣流量1.0 mL/min。進樣量1.0 μL，分流比20 ∶1。

質譜條件：電子轟擊式離子源(electron impact ion source，簡稱EI)，溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，發射電流34.6 μA，倍增器電壓837 V，接口溫度250 ℃，質量范圍10～500 u。

化合物鑒定及數據處理：采用色譜峰面積歸一化法計算化合物的相對含量[9]，結合WILEY275質譜圖庫和NIST2005標準質譜圖庫，通過HPMSD化學工作站進行化合物鑒定。方差分析采用SAS軟件，在0.05水平下分析不同樣品間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 晝夜變化對揮發油含量的影響

從圖1可以看出，1 d內的8個時間點廣藿香油含量變化較大，變化范圍為0.69%～1.01%，平均含量為0.83%。廣藿香揮發油的含量從00：00的0.81%上升至03：00的 0.88%，增長幅度為8.6%。06：00時含量下降到1 d中的最低值，為0.69%，09：00—12：00揮發油含量小幅上升至 0.82%，較06：00的增幅為18.8%。到15：00時廣藿香油含量上升至最高值，為1.01%，18：00時揮發油含量下降為 0.80%，較15：00時降幅為20.8%。采收時間在18：00—00：00 時揮發油含量趨于穩定。

2.2 晝夜變化對百秋李醇含量的影響

由圖2可知，在晝夜變化過程中，廣藿香油中的百秋李醇含量變化較大，其變化范圍為28.43%～34.08%，平均含量為31.36%。在00：00時百秋李醇的含量達到最低值，03：00含量上升至33.49%，增幅17.8%。03：00—06：00百秋李醇的含量呈下降趨勢，09：00—12：00百秋李醇的含量上升，12：00 時含量達到最高值，為34.08%，12：00—15：00含量由34.08%下降至29.79%，而15：00—21：00百秋李醇含量逐漸上升。

2.3 晝夜變化對其他揮發油成分含量的影響

廣藿香油成分在1 d內不同采收時間的含量變化見表1，可以看出，晝夜變化過程中，廣藿香油中β-廣藿香烯(β-patchoulene)、β-欖香烯(β-elemene)、石竹烯(caryophyllene)、α-愈創木烯(α-guaiene)、刺蕊草烯(seyehellene)、葎草烯(humulene)、α-布藜烯(α-bulnesene)和法呢醇(farnesol)等主要成分的含量變化表現出不同趨勢。

從圖3-a中可以看出，β-廣藿香烯和法呢醇含量在晝夜變化過程中大體上具有相反的積累趨勢。β-廣藿香烯含量的變動范圍為1.16%～3.24%，平均含量為2.50%；法呢醇的含量變化幅度較大，變化范圍為1.42%～7.65%，平均含量為 3.83%。在09：00時，法呢醇的含量達到最高值，為7.65%；β-廣藿香烯的含量則降為1 d中的最低值，為 1.16%。09：00—18：00，法呢醇含量先驟降到1.79%，然后上升至 15：00 的5.63%，之后再下降，然而β-廣藿香烯的含量表現出完全相反的變化趨勢。21：00時法呢醇和β-廣藿香烯含量均有所下降，且法呢醇含量降至最低值1.42%。21：00—06：00之間，β-廣藿香烯的含量先逐漸上升，至 03：00 時達到最高值，為3.24%，然后含量逐步下降；而法呢醇含量則是先急劇上升，在00：00時達到相對較高值，接著至06：00呈下降趨勢。

表1 晝夜變化對廣藿香油成分的影響

注：同類數據后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

揮發油中β-欖香烯、石竹烯、葎草烯3種化學成分的含量在1 d中呈現相似的變化趨勢(圖3-b)，平均含量分別為0.75%、2.38%、0.96%。在06：00時，這3種化學成分均達到含量最高值，分別為0.85%、2.75%、1.08%；21：00時，β-欖香烯的含量同樣為最高值0.85%。采樣時間從09：00—18：00，β-欖香烯、石竹烯的含量呈波動性變化，18：00 時達到最低值，分別為0.57%、1.60%；葎草烯含量的變化趨勢與上述2種物質相似，區別在于在18：00時其含量有小幅上升而不是下降。18：00—06：00，β-欖香烯、石竹烯、葎草烯的含量均先上升再小幅下降，然后上升至最高值。

在1 d中不同時間點采收的廣藿香，α-愈創木烯、刺蕊草烯和α-布藜烯的含量具有幾乎相同的動態變化趨勢(圖3-c)，平均含量分別為6.73%、4.68%、9.54%。α-愈創木烯、刺蕊草烯和α-布藜烯的含量均在18：00時達到最高值，分別為7.77%、5.58%和10.74%。18：00—00：00，3種成分含量均呈下降趨勢，且α-布藜烯含量在00：00時降至最低值，為8.72%。與00：00相比，03：00時3種成分的含量均有所上升，然后03：00—06：00含量逐漸下降，α-愈創木烯、刺蕊草烯含量在09：00時達到最低值，分別為 5.34%、3.61%。09：00—18：00，3種成分的含量呈波動性變化，并均于18：00時達到最高值。

3 討論與結論

植物次生代謝產物的生成由遺傳因素控制，但同時也受到各種環境因素(光照、溫度、土壤、灌溉、營養物質及季節和采收時間等)的影響[10-14]。揮發油的含量及其成分是芳香植物最重要的質量標準之一。研究表明，晝夜變化對綠薄荷(MenthaspicataL.)[15]、薔薇(RosadamascenaMill.)[16]、薰衣草(LavandulaangustifoliaMill.)[17]、芫荽(CoriandrumsativumL.)[18]等作物的揮發油產量和成分具有重要的影響，這些結果可能與光照、溫度和相對濕度等氣候條件的晝夜變化有關系。

廣藿香油被認為是廣藿香的主要藥用成分，同時也是香料工業中的一種重要的天然香料，其形成與積累受到多種因素(品種與產地[19]、植株部位與生長期[20]、施肥[21]、栽培方式[22]等)的影響。廣藿香油含量是評價廣藿香藥材品質的一個重要指標，關于廣藿香油含量隨植株生長和采收期的變化已有許多研究報道[20，23]，然而晝夜變化對廣藿香油含量的影響卻鮮見報道。分析成熟廣藿香在1 d內不同時間點揮發油含量的變化，對于確定廣藿香藥材的最佳采收時間具有十分重要的意義。本研究以海南廣藿香為試驗材料，24 h內每隔3 h采樣1次，結果表明，晝夜變化過程中廣藿香油的含量在15：00時達到最高值，06：00時含量最低，其余時間含量較穩定。1 d中氣溫隨時間的連續變化稱為氣溫的日變化，通常在14：00—15：00達到最高值，06：00左右(日出前后)最低。這些結果表明，較高的溫度可能更有利于廣藿香中揮發油的生成與積累。

百秋李醇是歷版《中華人民共和國藥典》規定的用于評價廣藿香藥材及廣藿香油質量的指標成分，其含量受到栽培條件、生長環境、采集部位和生長期等因素的影響。學者將廣東廣州、高要、雷州、吳川、遂溪及海南萬寧等6個產地的廣藿香分為2個化學型：揮發油含量最高成分為百秋李醇的“瓊香類”，稱為廣藿香醇型；揮發油含量最高成分為廣藿香酮的“牌香類”，稱為廣藿香酮型[24]。研究分析這6個產地廣藿香油中百秋李醇在不同采收時期的含量變化發現，產地與采收時期均對百秋李醇的含量有較大影響，廣東雷州、遂溪和吳川產廣藿香在10月采收時其揮發油中的百秋李醇含量最高，海南萬寧以7月份采收時含量最高，而廣東高要則以11月份采收時含量最高。陳英采用GC-MS技術探討廣藿香生長發育與百秋李醇含量積累的關系，結果表明，海南廣藿香油中百秋李醇的含量從植株生長的第135天到第210天呈上升趨勢，且在第210天時達到最大值[20]。不同生長環境、部位、采收期廣藿香中的百秋李醇含量都存在明顯差異，嚴重影響廣藿香藥材的穩定性及臨床療效，因而有必要對廣藿香中的百秋李醇形成與積累機制進行研究。

百秋李醇對廣藿香油的質量控制具有重要意義，百秋李醇的含量不低于30%是目前市場上對廣藿香油的最低標準[25]，因此，植株1 d內不同時間點的百秋李醇含量可以作為確定廣藿香最佳采收時間的重要指標。本研究結果表明，百秋李醇的含量在12：00時達到最高值，12：00—21：00其含量呈先急劇下降后緩慢上升的變化趨勢，在00：00時含量下降至最低值，00：00—06：00百秋李醇含量呈先急劇上升后逐漸下降的變化趨勢。Zlatev報道，香芹酮在蒔蘿油中的積累同樣在12：00時達到最大值[26]。

研究發現，廣藿香油成分隨產地、生長期、植株部位的不同而有所差異。在廣東吳川、萬寧、遂溪及雷州等地的廣藿香油中，百秋李醇為含量最高的成分，而廣東高要和廣州等地產的廣藿香揮發油成分則與其他產地明顯不同，廣藿香酮為其含量最高的成分[24，27]。在海南廣藿香根、莖和葉揮發油中，百秋李醇為含量最高的成分，百秋李醇、α-愈創木烯等倍半萜類化合物的含量均在植株生長至第210天時達最高值[28]。本研究通過對晝夜變化過程中廣藿香油成分含量的差異進行分析發現，各成分的含量均受到采收時間的影響。α-愈創木烯、刺蕊草烯、α-布藜烯等成分在揮發油中的含量超過3%，在晝夜變化過程中具有基本相同的動態變化趨勢，且均在18：00時含量達到最大值。β-欖香烯、石竹烯、葎草烯3種化學成分的含量在1 d中呈現相似的變化趨勢，其中石竹烯、葎草烯含量在 06：00 達最高值，β-欖香烯含量在06：00和21：00達最高值。然而β-廣藿香烯和法呢醇在24 h內常會出現相反的變化趨勢，09：00時法呢醇的含量達到最高值，β-廣藿香烯含量則達到最低值。

[1]吳友根，郭巧生，鄭煥強. 廣藿香本草及引種歷史考證的研究[J]. 中國中藥雜志，2007，32(20)：2114-2117，2181.

[2]中國藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S]. 北京：化學工業出版社，2010：42-43.

[3]Wu Y G，Guo Q S，He J C，et al. Genetic diversity analysis among and within populations ofPogostemoncablinfrom China with ISSR and SRAP markers[J]. Biochemical Systematics and Ecology，2010，38(1)：63-72.

[4]Park H M，Park I K. Larvicidal activity ofAmyrisbalsamifera，DaucuscarotaandPogostemoncablinessential oils and their components againstCulexpipienspallens[J]. Journal of Asia-Pacific Entomology，2012，15(4)：631-634.

[5]Su J Y，Tan L R，Lai P，et al. Experimental study on anti-inflammatory activity of a TCM recipe consisting of the supercritical fluid CO2extract ofChrysanthemumindicum，patchouli oil and zedoary turmeric oilinvivo[J]. Journal of Ethnopharmacology，2012，141(2)：608-614.

[6]楊賛熹，謝培山. 中藥廣藿香抗真菌成分——廣藿香酮(Pogostone)的分離及結構測定[J]. 科學通報，1977，12(8)：318-320.

[7]Lu S，Xu R，Jia J W，et al. Cloning and functional characterization of aβ-pinene synthase fromAriernisiaannuathat shows a circadian pattern of expression[J]. Plant Physiology，2002，130(1)：477-486.

[8]吳友根，吳連花，何際嬋. 廣藿香揮發油提取條件優化及其方法比較[J]. 江蘇農業科學，2011，39(2)：388-390.

[9]Adams R. Identification of essential oil components by gas chromatography/quadrupole mass spectroscopy[M]. USA：Allured Publishing Corp，2001.

[10]Rao B R，Bhattacharya A，Kaul P，et al. Yield and chemical composition of rose-scented geranium(Pelargoniumspecies) oil at different times of harvesting[J]. Journal of Essential Oil Research，2001，13(6)：456-459.

[11]Baghalian K，Haghiry A，Naghavi M R. Effect of saline irrigation water on agronomical and phytochemical characters of chamomile (MatricariarecutitaL.)[J]. Scientia Horticulturae，2008，116(4)：437-441.

[12]Ramezani S，Ramezani F，Rasouli F，et al. Diurnal variation of the essential oil of four medicinal plants species in central region of Iran[J]. Research Journal of Biological Sciences，2009，4(1)：103-106.

[13]Zheljazkov V D，Cantrell C L，Astatkie T，et al. Yield，content，and composition of peppermint and spearmints as a function of harvesting time and drying[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58(21)：11400-11407.

[14]Butkiene R，Mockute D. The variability of the essential oil composition of wildLedumpalustreL. shoots during vegetation period[J]. Journal of Essential Oil Research，2011，23(1)：9-13.

[15]Bufalo J，Zheljazkov V D，Cantrell C L，et al. Diurnal effects on spearmint oil yields and composition[J]. Scientia Horticulturae，2015，182：73-76.

[16]Kumar R，Sharma S，Sood S，et al. Effect of diurnal variability and storage conditions on essential oil content and quality of damask rose (RosadamascenaMill.) flowers in north western Himalayas[J]. Scientia Horticulturae，2013，154：102-108.

[17]Hassiotis C N，Lazari D M，Vlachonasios K E. The effects of habitat type and diurnal harvest on essential oil yield and composition ofLavandulaangustifoliaMill.[J]. Fresenius Environmental Bulletin，2010，19(8)：1491-1498.

[18]Ramezani S，Rahmanian M，Jahanbin R，et al. Diurnal changes in essential oil content of coriander(CoriandrumsativumL.)aerial parts from Iran[J]. Research Journal of Biological Sciences，2009，4(3)：277-281.

[19]陳文光. 越南與中國產廣藿香質量比較及產地加工研究[D]. 廣州：廣州中醫藥大學，2011：63-64.

[20]陳 英. 廣藿香中百秋李醇的動態積累及PTS基因的克隆與表達研究[D]. 海口：海南大學，2015：23-25.

[21]Singh M，Rao R S G. Influence of sources and doses of N and K on herbage，oil yield and nutrient uptake of patchouli[Pogostemoncablin(Blanco) Benth.]in semi-arid tropics[J]. Industrial Crops and Products，2009，29(1)：229-234.

[22]喻良文，鐘燕珠，李 薇，等. 不同繁殖方式的廣藿香藥材揮發油分析[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2008，19(4)：296-298.

[23]羅集鵬，郭曉玲，馮毅凡. 不同采收期海南廣藿香揮發油成分分析[J]. 中藥材，2002，25(1)：21-23.

[24]羅集鵬，劉玉萍，馮毅凡，等. 廣藿香的兩個化學型及產地與采收期對其揮發油成分的影響[J]. 藥學學報，2003，38(4)：307-310.

[25]Yahya A，Yunus R M. Influence of sample preparation and extraction time on chemical composition of steam distillation derived patchouli oil[J]. Procedia Engineering，2013，53：1-6.

[26]Zlatev S. Diurnal variations in the essential oil of dill[J]. Rast Nauki，1977，14：45-49.

[27]郭曉玲，馮毅凡，羅集鵬. 吳川產廣藿香揮發油成分動態變化[J]. 中藥材，2002，25(4)：262-263.

[28]Chen Y，Wu Y G，Xu Y，et al. Dynamic accumulation of sesquiterpenes in essential oil ofPogostemoncablin[J]. Revista Brasileira de Farmacognosia，2014，24(6)：626-634.