4株芽孢桿菌的分離鑒定與生物學特性分析

石水琴， 蔣 雯， 袁 林， 祁克宗， 涂 健， 宋祥軍

(1.安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽合肥 230036； 2.安徽農業大學生命科學學院，安徽合肥 230036； 3.安徽農業大學動物科技學院，安徽合肥 230036)

嗜熱微生物是一類可以在45 ℃以上環境中生長繁殖的極端微生物，因其細胞和蛋白質具有獨特的耐熱性，已引起廣泛關注，并且逐漸成為人們開發利用的重要微生物資源。世界各國科學家不斷從各種自然高溫生態環境、地熱環境中篩選和分離出不同屬、種的嗜熱菌[1]。嗜熱菌在實際應用中表現出顯著的作用效果和潛在的應用前景。農業生產中的肥料、飼料及環境保護中常用的微生物活菌制劑包括多種微生物，其中芽孢桿菌是一類需氧或兼性厭氧菌，菌體本身含有大量的營養物質，隨著它們在動物消化道內的繁衍、代謝，可產生維生素、有機酸、蛋白質和未知生長因子等，參與機體新陳代謝，同時還具有生物拮抗功能，可以減少動物腸道有害菌的數量，維持消化道菌群平衡[2-5]，在實際生產中得到了廣泛的應用。

目前我國允許作為生態制劑的微生物有乳酸菌制劑、糞腸球菌制劑、芽孢桿菌制劑、酵母菌制劑和復合微生態制劑等。但通常使用的益生菌菌株的抗逆性較差，不耐熱，在飼料加工過程中損失較大，不能像芽孢桿菌可以直接加到配合飼料中，因此嗜熱芽孢桿菌作為益生菌的一種，具有其特有的生物特性。與其他微生物活菌制劑相比，芽孢桿菌具有在條件不利的環境下形成芽孢將自己保護起來的特點，且復活率高。同時芽孢桿菌還具有耐酸、耐鹽、耐高溫及耐積壓等優點[6-8]，因此在飼料、肥料的生產中具有較高的穩定性。目前在肥料、飼料工業及環保中應用的主要有地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)等，在使用時多制成休眠狀態的活菌制劑或與乳酸菌混合使用[9]，有益的芽孢桿菌能促進機體免疫器官及組織的成熟，使這些器官、組織處于高度準備狀態，可促進T-淋巴細胞、B-淋巴細胞數量增加，從而提高機體的體液免疫和細胞免疫水平，因此，芽孢桿菌在動物和人體的微生態調節中也得到了高度的重視和廣泛的應用。

本研究以水產飼料為材料，采用常規細菌分離鑒定法結合分子生物學法從水產飼料中分離鑒定出4株嗜熱芽孢桿菌，并對菌株的耐高溫、耐酸、耐膽鹽及對大腸桿菌、沙門氏菌抑菌性等一系列生物學特性進行研究，為后續試驗以及微生態飼料添加劑的開發及應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為水產飼料蛋白粉，購自當地市場。

1.2 培養基

1.2.1 搖瓶培養基 稱取2.5 g LB培養基溶于100 mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min，4 ℃備用。

1.2.2 產蛋白酶初篩選擇性培養基 干酪素8 g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4)1 g，磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.36 g，瓊脂20 g，氯化鈉(NaCl)5 g，加入1 000 mL蒸餾水，加熱攪拌，pH值7.4±0.2，121 ℃高壓滅菌15 min，4 ℃備用。

1.2.3 產淀粉酶初篩選擇性培養基 牛肉浸膏5 g，酪蛋白水解物17.5 g，淀粉1.5 g，瓊脂13.5 g，加入1 000 mL蒸餾水，加熱攪拌，pH值7.2±0.2，121 ℃高壓滅菌15 min，4 ℃保存備用。

1.3 芽孢桿菌的分離、純化

取2 g樣品溶解到20 mL無菌水中，振蕩溶解。取混合液接種到20 mL LB液體培養基中，于45 ℃振蕩(150 r/min)培養24～48 h，待培養基變得混濁后，取1 mL培養液按一定的稀釋度稀釋，涂布于LB固體培養基上，置于50 ℃恒溫培養箱中培養24～48 h，挑取單菌落，接于新鮮培養基上，重復多次直至菌落純化。選取生長較好的A2、A3、A4、A5菌株進行理化性質的研究。

1.4 生長曲線及最適生長條件測定

生長曲線的測定：將菌液按1%的比例接種到100 mL LB培養基中，45 ℃振蕩培養，每2 h測定1次。

菌株最適生長溫度的測定：將處于對數生長期早期的LB菌株培養液0.5 mL接種到5 mL LB培養基中，分別置于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃水浴振蕩培養18 h。

最適生長pH值的測定：將處于對數生長期早期的LB菌株培養液0.5 mL分別接種到pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5的5 mL LB液體培養基中，置于45 ℃水浴振蕩培養18 h。

以上試驗均設平行。用721型分光光度計比色測定D600 nm進行生長條件的分析。

耐膽鹽試驗：菌液按1 ∶50(體積比)的接種量分別接種于膽鹽濃度為0、3、6 g/L的液體培養基中，每組重復3次，45 ℃、200 r/min 振蕩培養12 h后測定菌液的D600 nm。

1.5 產淀粉酶和蛋白酶試驗

產淀粉酶試驗：首先配制產淀粉酶初篩試驗的MH培養基，121 ℃高壓滅菌15 min，制成平板備用；將分離出來的A2、A3、A4、A5菌株分別接種于裝有LB液體培養基的試管中，45 ℃、200 r/min振蕩培養(12±2)h；將培養好的A2、A3、A4、A5菌株取5 μL點樣于產淀粉酶培養基上，在(45±1)℃恒溫培養箱內培養24 h，待長出單菌落，滴入盧戈氏碘液覆蓋菌落，觀察是否產生透明圈。

產蛋白酶試驗：首先配制產蛋白酶初篩試驗培養基，121 ℃ 高壓滅菌15 min，制成平板備用；將分離出來的A2、A3、A4、A5菌株分別接種于裝有LB液體培養基的試管中，45 ℃、220 r/min振蕩培養(12±2)h；將培養好的A2、A3、A4、A5菌株取5 μL點樣于產蛋白酶培養基上，在45 ℃恒溫培養箱內培養24 h，待長出單菌落，檢察是否產生蛋白酶水解圈。

1.6 抑菌試驗

試驗菌株菌液、大腸桿菌(ATCC 44102)及沙門氏菌菌液，分別以體積比1 ∶50(約1×106CFU/mL)的接種量同時接種于 10 mL 肉湯液體培養基中，另以滅菌生理鹽水替代試驗菌株作為陽性對照。每組設3個重復，37 ℃、200 r/min培養24 h。采用平板活菌計數法，取樣涂布于麥康凱瓊脂平皿，37 ℃過夜，紅色菌落為大腸桿菌，其余為沙門氏菌，記錄大腸桿菌和沙門氏菌菌落數，計算各試驗菌株對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌率。

1.7 分子鑒定

用16S rDNA序列進行鑒定，以確定其歸屬。PCR產物送上海捷瑞生物工程有限公司測序。分別將獲得的16S rDNA序列在GenBank數據庫中進行Blast比對，選取相似度95%以上的序列進一步分析。然后采用DNAMAN 5.2.9軟件進行分析，繪制系統發育樹。

1.8 透射電鏡觀察

處于對數生長期早期的細胞用固定液固定好后，制備超薄切片置于透射電鏡下進行結構觀察。

2 結果與分析

2.1 分離的菌落及形態結構觀察

通過稀釋平板涂抹法分離得到4株芽孢桿菌，將其接種到普通營養瓊脂培養基上，45 ℃恒溫培養24～48 h后觀察，菌落為圓形，邊緣不規則，表面有皺襞。挑取單個菌落涂片，可見呈革蘭陽性。透射電鏡觀察看到4株芽孢桿菌細胞呈直桿狀，常以成對或鏈式排列，具圓端，都具有明顯的細胞壁結構，且都能明顯觀察到周圍有菌毛，如圖1所示。

2.2 分離株的生化鑒定

對4株菌株的細菌形態特征、革蘭氏染色觀察以及觸酶與發酵葡萄糖、木糖、甘露醇、木糖、蔗糖等常規生化試驗結果如表1所示。

表1 4株參試菌的生理生化特征

注：“+”表示陽性或能利用；“-”表示陰性或不能利用；“+/-”表示同一屬具體不同菌株之間的細微差別。

2.3 最適生長條件

2.3.1 生長曲線的測定 從0 h開始，每2 h測1次D600 nm，直到30 h，4株菌株基本進入穩定期。如圖2所示，A2、A3、A4、A5菌株均在12 h達到對數期，分別在26、20、20、 26 h 達到穩定期。

2.3.2 菌株最適生長溫度的測定 將4株菌株置于不同溫度搖床培養，在18 h后同時測定菌液的D600 nm，以空白培養基作為對照，得到的結果如圖3所示，可見培養溫度對4株菌株的生長有一定的影響。在所選溫度范圍內，菌體生物量隨溫度的變化而變化，當培養溫度低于40 ℃時，菌體生長緩慢；A2、A4、A5菌株培養溫度在40～45 ℃之間時，菌體生長情況較好，以45℃最好，之后隨著溫度的升高，生長速度減慢。A3菌株在50 ℃時菌體生物量達到最高值。

2.3.3 菌株最適生長pH值的測定 將4株菌株置于不同pH值條件下，在45 ℃恒溫培養18 h后同時測定菌液的D600 nm，以空白培養基作為對照，測得的結果如圖4所示：初始pH值對4株菌株生長有明顯的影響，當培養基pH值低于6.0時，菌體生長緩慢，當初始pH值在6.0～7.5之間時，菌體生長情況較好。A2、A3菌株最適pH值為7.5，A4、A5菌株最適pH值為7.0。

2.4 耐膽鹽試驗

由圖5可見，4株菌株各組的生長都受到膽鹽的抑制，D600 nm都低于不含膽鹽組，相比較而言，A2菌株耐受性較好。

2.5 產蛋白酶和淀粉酶結果分析

4株菌株產蛋白酶和淀粉酶結果如圖6所示，A2、A3菌株產淀粉酶，A4、A5菌株基本不產淀粉酶(圖6左圖)；4株菌株均能產蛋白酶，且A2菌株產蛋白酶能力最強(圖6右圖)。

2.6 抑菌試驗

由表2可見，4株菌株對共同培養24 h的大腸桿菌都沒有抑制作用；A2、A5菌株對共培養的沙門氏菌的抑菌率分別為31.2%、22.9%，其他菌株為0。

表2 各菌株對共培養的大腸桿菌和沙門氏菌的抑制效果

2.7 16S rDNA基因系統發育分析

測序獲得的A2、A3、A4和A5菌株16S rDNA基因片段長度分別為1 277、1 181、1 213和909 bp。利用BLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，將所測菌株A2、A3、A4和A5的16S r DNA序列與GenBank數據庫中已知細菌的16S rDNA序列進行比較鑒定，已知A3、A4、A5菌株與Bacilluslicheniformisstrain H37的同源性分別為98%、99%、100%，說明A3、A4和A5菌株屬于嗜熱地衣芽孢桿菌屬(Bacilluslicheniformis)；已知A2與Bacillussubtilisstrain CC2FG1的同源性是97%，說明A2菌株屬于嗜熱枯草芽孢桿菌屬(Bacillussubtilis)。采用DNAMAN 5.2.9軟件繪制的系統發育樹見圖7。

3 討論

從水產飼料中分離獲得4株菌株，細菌形態特征、革蘭氏染色等鑒定結果顯示，4株菌株與芽孢桿菌相似。由于芽孢細菌形態特征及其生理生化特性極其相似，因此僅通過形態特征及其生理生化特性只能初步確定這4株菌株為芽孢桿菌。基于16S rDNA特異性PCR擴增的檢測等多種方法結合使用，經鑒定，A2菌株與Bacillussubtilisstrain CC2FG1的同源性是97%，說明A2菌株屬于嗜熱枯草芽孢桿菌；A3、A4、A5菌株與Bacilluslicheniformisstrain H37的同源性分別是 98%、99%、100%，說明A3、A4和A5菌株屬于嗜熱地衣芽孢桿菌。

本研究以水產飼料為材料，分離篩選優良的芽孢桿菌菌株并對其進行初步鑒定，以此大致了解水產飼料中芽孢桿菌的菌相構成。在此基礎上探究了芽孢桿菌對常見致病菌大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌作用，以期研究結果能為畜牧農業生產及微生態調節劑的制備提供前期理論依據和優良的微生物資源。

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