致犢牛腦炎β-溶血性牛鏈球菌的分離鑒定及藥敏試驗

宋 健， 高建鵬， 龔子桓， 王蒙蒙， 齊亞銀

(石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000)

鏈球菌屬(Streptococcus)是一群觸酶試驗陰性、呈鏈狀排列的革蘭氏陽性菌，該菌屬種類繁多，目前臨床上仍沿用Lancefield血清學方法進行分群(A、B、C、D、F、G等18個群)或根據溶血現象(β溶血、α溶血或草綠色溶血、γ溶血或不溶血)進行分類，近年來鏈球菌屬的分類發生了一些變化，提出了新的菌群劃分概念。醫學上重要的鏈球菌主要有化膿性鏈球菌、草綠色鏈球菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌、牛鏈球菌等，是人類重要的病原之一，可引起敗血癥、肺炎及腦膜炎等疾病，同時也是其他多脊椎動物如豬、牛等重要病原菌之一。

2015年初冬，新疆奎屯某規模化牛場的部分犢牛發生了以腦炎為主的病例，3～30日齡發病不等，發病犢牛表現體溫升高、咳嗽、共濟失調、頭低耳耷、眼球嚴重外突、拱背、精神沉郁、消瘦、抗生素治療效果不佳。剖檢瀕死期犢牛發現，腦膜嚴重化膿(圖1)，肺臟出血且有肉變，腎盂出血，小腸嚴重出血，腸黏膜脫落，腸系膜淋巴結腫大。

為查明導致該病發生的主要致病菌，筆者為牛場提供了科學合理的治療方案，即采用常規微生物學手段和方法，對患腦炎的犢牛進行病原菌的分離和鑒定，并對分離株溶血性及藥物敏感性進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基與生化試劑 LB肉湯培養基，普通瓊脂培養基，鏈球菌肉湯培養基，10%滅活綿羊血瓊脂培養基、鏈球菌選擇培養基。各種生化試驗用培養基等參照文獻[1]配制，4 ℃ 冰箱保存備用；細菌微量發酵管購自于浙江省杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.2 主要器械 超凈工作臺，上海鴻都電子科技有限公司；隔水式恒溫培養箱，北京市永光明醫療儀器廠；4 ℃ 冰箱，海信容聲冰箱有限公司。

1.1.3 藥敏試驗 萬古霉素、阿奇霉素、四環素、青霉素、阿莫西林、環丙沙星、恩諾沙星、羅紅霉素、卡那霉素、慶大霉素等藥敏紙片為浙江省杭州天和微生物試劑有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 樣品來源 無菌采集新疆奎屯某發病牛場的犢牛肝臟、腸系膜淋巴結、脾臟、心血、肺臟、腦等共6份，分別放入滅菌的培養皿內，然后在放入帶有冰塊泡沫箱內密封并盡快帶回實驗室。

1.2.2 分離培養 無菌采集瀕死期及死亡的犢牛的肝臟、心血、肺臟、腦，接種于LB肉湯培養基，置37 ℃恒溫箱中增菌培養24 h后，革蘭染色鏡檢，初步篩選出革蘭陽性球菌，再通過四區劃線法將培養物轉接于普通瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養24 h。觀察菌落形態并染色鏡檢，挑選可疑革蘭陽性球菌的單個菌落接種于鏈球菌肉湯培養基內，置于37 ℃恒溫培養箱24 h后，染色鏡檢。隨后將菌液接種于鏈球菌選擇性培養基上，置于含體積分數為5%的CO2恒溫(37 ℃)培養箱中進行分離純化，培養12 h后挑選單個菌落，接于10%滅活綿羊鮮血LB平板上，置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，觀察細菌菌落形態和溶血情況。

1.2.3 生化鑒定 分離菌的生化鑒定，參照文獻[2-3]的方法進行。將分離菌株分別接種于含甘露醇、山梨醇、馬尿酸鈉、甘油、海藻糖、蔗糖、果糖、七葉苷、阿拉伯糖、菊糖、棉子糖、鼠李糖等微量生化反應管中，37 ℃培養24 h，觀察其生化反應特性。

1.2.4 藥敏試驗 采用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗，參照趙占峰等根據NCCLS(美國臨床實驗室標準化委員會)標準判定試驗結果[4]。將所保存的純化菌株分別在37 ℃營養肉湯中培養18～24 h，用無菌生理鹽水將菌液稀釋至濃度約為2×106個/mL，用無菌棉拭子蘸取菌液，均勻涂布于營養瓊脂平板。每個平板貼6張藥敏紙片為宜，2張紙片相距 25 mm，紙片與平板邊緣10～15 mm，并輕按紙片中心，使其附著嚴密，37 ℃恒溫培養24 h。測量抑菌圈直徑，判定鏈球菌對藥敏紙片的敏感性，判定標準見表1。

表1 藥敏試驗判定標準

注：“R”為耐藥；“I”為中度敏感；“S”為高度敏感。

2 結果與分析

2.1 細菌形態觀察

病死犢牛的肺臟，肝臟和心血抹片瑞氏染色鏡檢，均有球菌，腦組織抹片瑞士染色鏡檢，可見短鏈和成對排列的球菌(圖2)。病死犢牛腦組織分離培養物革蘭染色呈鏈狀排列的革蘭氏陽性球菌(圖3)。

2.2 病原菌分離培養及溶血特性

病變組織無菌接入肉湯培養基中培養24 h后，溶液變渾濁。在普通瓊脂上生長貧瘠且緩慢；在鏈球菌選擇培養基上為白色隆起，邊緣整齊的針尖大小菌落；在體積分數為5% CO2中生長良好。分離菌在10%滅活綿羊血瓊脂平板上菌落灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊，有溶血現象，直徑為2.20～2.41 mm，呈現β溶血(圖4)。

2.3 生化特性

分離菌觸酶試驗為陰性，在pH值9.6、6.5% NaCl中不生長，在溫度為10、45 ℃時不生長；在400 mL/L甘露醇、山梨醇、馬尿酸鈉、甘油、海藻糖、蔗糖、果糖、七葉苷中生長；不能利用阿拉伯糖、菊糖、棉籽糖和鼠李糖。結果表明，分離株符合牛鏈球菌的生化特性。生化特性鑒定結果見表2。

表2 分離株的生化反應結果

注：“+”為產酸不產氣/陽性；“-”為不產酸不產氣/陰性。

2.4 藥敏試驗

對分離培養獲得的純化菌株進行藥敏試驗，結果見表3。

表3 分離株的藥敏試驗結果

3 討論與結論

目前，能夠引起動物腦炎的病原有細菌、病毒、真菌、立克次體、原蟲等。其中，細菌主要有肺炎鏈球菌、腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、B族鏈球菌和奈瑟球菌等[3-5]。病毒主要有單純皰疹病毒、日本腦炎病毒、西尼羅腦炎病毒等約有100多種病毒可致人和動物得腦炎[6]。根據離株的培養特性、染色特點、形態觀察及生化試驗可知，導致此次犢牛腦炎的細菌為β-溶血性牛鏈球菌。

藥敏試驗結果表明，分離株對青霉素、萬古霉素、阿奇霉素、阿莫西林、環丙沙星、恩諾沙星、羅紅霉素敏感，對四環素、卡那霉素、慶大霉素耐受，說明該菌株具有多重耐藥性。鏈球菌是革蘭陽性菌，理論上很多藥物對其有療效。但近年來由于抗生素的濫用，如在動物飼料中長期添加抗生素用于促進生長及預防和治療疾病，發生疾病后未經獸醫診斷就盲目大量使用多種抗生素等，不僅治療成本提高，而且產生了大量耐藥菌株，使得疾病難以控制。因此，牛場在防治鏈球菌病時，應對菌株進行藥敏試驗，用2～3種敏感藥物按療程和足夠的劑量交替使用。

[1]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001.

[2]王建永，張 磊，趙月蘭，等. 腹瀉犢牛病原分離鑒定及藥敏實驗[J]. 動物醫學進展，2010，31(5)：118-121.

[3]Metter K B，Lisbeth N P，Jens K M.Eight-plex PCR and liquidarray ditection of bacterial and viral pathogens in cerebrospinal fluid from patients with suspected memingitis[J]. J Clin Microbiol，2009，47(4)：908-913.

[4]趙戰峰，宋軍科，于三科. 奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定[J]. 動物醫學進展，2010，31(4)：113-115.

[5]王慧敏，高云英，田飛鵬. 腦膜炎球菌外膜蛋白NhhA的表達及免疫效果評價[J]. 動物醫學進展，2010，31(12)：53-57.

[6]Ye C T，Abraham S，Wu H Q，et al. Silencing early viral replication in macrophages and denritic cells effectively suppresses flavivirus encephalitis[J]. PLoS One，2011，6(3)：1-7.