固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A對玉米和水稻的促生作用及其根際定殖動態(tài)

程杰杰， 殷超凡， 薩爾山別克·熱阿合曼， 孫帥欣， 陳云鵬

[上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院/農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)重點實驗室，上海 200240]

氮元素作為構(gòu)成蛋白質(zhì)和核酸的重要元素，對動植物及微生物都有非常重要的意義。土壤氮素在作物氮素供應(yīng)上占有重要地位，通過向耕地中增施氮肥來提高作物產(chǎn)量是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要措施[1]。空氣中雖然存在大量的氮氣，但不能直接被植物吸收利用，只有轉(zhuǎn)化為硝酸鹽、亞硝酸鹽等化合物后才能被植物吸收。生物固氮即固氮微生物將大氣中的氮氣還原成氨的過程，是自然界氮循環(huán)的主要環(huán)節(jié)[2]。當前氮肥的主要來源是化工生產(chǎn)，化學氮肥的使用曾為我國農(nóng)作物的增產(chǎn)作出了突出貢獻[3-4]，但同時產(chǎn)生很多環(huán)境問題，造成農(nóng)業(yè)點源污染和面源污染[5-7]。

由于氮素化肥的生產(chǎn)伴隨著能源的消耗和日趨嚴重的環(huán)境污染等問題，因此生物固氮研究日益受到各國政府的重視。目前發(fā)現(xiàn)的具有生物固氮能力的微生物多為細菌，有100多個屬，占細胞系統(tǒng)發(fā)育分支的1/2以上[8]。不同固氮菌的固氮能力差異比較明顯，即使是同種固氮菌在不同的環(huán)境條件下或在不同的宿主內(nèi)也會表現(xiàn)出固氮能力的差異[9]。雖然固氮菌的固氮能力差異較大，但均能在一定程度上促進植物的生長，提高農(nóng)作物的產(chǎn)量[10]。

本研究測定固氮菌GXGL-4A在LB液體培養(yǎng)基(有氮)、A15液體培養(yǎng)基(無氮)中的生長曲線；以玉米、水稻為試驗對象，在其生長過程中施用不同濃度的GXGL-4A，通過測定玉米、水稻的鮮質(zhì)量、株高、根長、根鮮質(zhì)量等指標，并進行數(shù)理統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，GXGL-4A對水稻和玉米的生長具有促生作用，且該促生作用在一定范圍內(nèi)隨GXGL-4A濃度的增大而增強；對GXGL-4A在玉米根際土壤中的消長動態(tài)進行監(jiān)測，獲得其在玉米根際土壤中的消長動態(tài)變化情況，可為固氮菌固氮機制的進一步研究及微生物菌肥的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 固氮菌KosakoniaradicincitansGXGL-4A(簡稱GXGL-4A)分離自廣西桂林的玉米根部，為革蘭氏陰性菌，有莢膜，能泌銨和胞外多糖類黏性物質(zhì)，菌體大小約為1.5 μm×0.5 μm。菌體呈桿狀，具端生鞭毛。

載體質(zhì)粒pET28a(+)攜帶有卡那霉素抗性基因(kanr)標記，由筆者所在實驗室余傳金惠贈。

1.1.2 種子 玉米種子先玉335(非抗旱品種)和寧玉721(抗旱品種)均購自青上農(nóng)業(yè)科技(吉林)有限公司，水稻種子CBB23由上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院陳功友教授實驗室饋贈。

1.1.3 主要試劑及儀器 2×TaqPCR Master Mix、6×Loading buffer、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒及SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA marker，購自天根生化科技(北京)有限公司；Goldview核酸染料，購自上海少辛生物科技有限公司；卡那霉素(Kan)，購自美國Amresco公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

Leica DM2500熒光顯微鏡(萊卡微系統(tǒng)公司)；BSW-200B 臺式恒溫搖床(上海啟步生物科技有限公司)；ZDP-2120電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；Minispin?離心機、Eppendorf BioPhotometer生物分光光度計(德國Eppendorf公司)；超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 固氮菌GXGL-4A生長曲線測定 以體積分數(shù)1%的接種量將固氮菌GXGL-4A接入LB液體培養(yǎng)基(有氮)中，每隔1 h用分光光度計測量1次菌液在600 nm處的吸光度并進行記錄。以相同接種量將固氮菌GXGL-4A接入A15液體培養(yǎng)基(無氮)中，8 h后以相同方法測量菌液在600 nm處的吸光度并進行記錄，以后每隔3 h進行1次測量。

1.2.2 固氮菌GXGL-4A促生作用研究

1.2.2.1 種子消毒與催芽 將種子在水中浸泡4 h后，用蒸餾水徹底沖洗干凈，然后移至75%乙醇中處理2 min，用無菌水清洗2次后，用5% NaClO溶液浸泡5 min，再用無菌水清洗2次。將消毒的玉米和水稻種子用紗布包起來后置于 28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至出芽，出芽標準為胚根與種子等長。

1.2.2.2 固氮菌GXGL-4A的培養(yǎng) 將固氮菌GXGL-4A以1%接種量接種到LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、160 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)約4 h(D600 nm約為1.0)，然后在離心機中以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，用無菌水洗滌菌體沉淀2次后，再用無菌水將其依次稀釋為104、106、108CFU/mL等3個濃度梯度，備用。

1.2.2.3 玉米、水稻種植與接種處理 將發(fā)芽的玉米種子植入塑料花盆(內(nèi)徑20 cm、高20 cm)，出苗期每隔24 h于同一時間(12：00)澆水1次，觀察記錄出苗情況。將大小長勢基本一致的玉米、水稻幼苗分別移栽到相同規(guī)格的塑料花盆內(nèi)，設(shè)置對照組(CK)和3個濃度梯度(104、106、108CFU/mL)試驗組，3次重復(fù)。移栽2 d(展出1或2張真葉)后，試驗組每隔3 d對幼苗莖基部施加1次固氮菌GXGL-4A(1 mL/株)，對照組加等量無菌水，共計接種7次，培養(yǎng)期間每天12：00澆1次水，以保持土壤濕潤。

1.2.2.4 數(shù)據(jù)采集與分析 接種后30 d，測量每株玉米、水稻的鮮質(zhì)量、株高、根長、根鮮質(zhì)量，試驗數(shù)據(jù)通過Excel和SPSS進行分析處理。

1.2.3 根際定殖動態(tài)研究

1.2.3.1 固氮菌GXGL-4A卡那霉素抗性標記 將帶有pET28a(+)質(zhì)粒的大腸桿菌以體積分數(shù)1%的接種量接入LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)約 12 h，然后用試劑盒提取質(zhì)粒。將提取好的質(zhì)粒用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入固氮菌GXGL-4A中，將轉(zhuǎn)化菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kan)平板上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)，然后挑取陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.3.2 土壤處理 采集大田熟土600 g，稱取其中的300 g平鋪于托盤內(nèi)，置于120 ℃恒溫箱內(nèi)干熱滅菌5 h，待土壤自然冷卻后裝入無菌袋內(nèi)備用；剩余土壤不進行滅菌處理，而是直接裝入無菌袋內(nèi)備用。

1.2.3.3 種子消毒與催芽 種子消毒與催芽方法同 “1.2.2.1” 節(jié)。種子出芽后，播種于含50 g滅菌土的塑料采樣罐(高10 cm，內(nèi)徑6 cm)內(nèi)，即為封閉系統(tǒng)處理；播種于含50 g非滅菌土的塑料采樣罐內(nèi)，即為開放系統(tǒng)處理。每罐播3粒種子，設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3.4 標記菌GXGL-4A的培養(yǎng)及在玉米根際土壤的釋放 待種子破土后，采用灌根法接種固氮菌GXGL-4A。標記菌于含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在 37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h后，取5 mL用無菌水稀釋至 50 mL(接種濃度1×107CFU/mL)，用移液器緩慢地釋放至玉米幼苗的根際土壤中。

1.2.3.5 消長動態(tài)監(jiān)測 分別于釋放后1、3、6、9、12、15 d取3罐幼苗根際土壤各1 g，加入到9 mL無菌水中渦旋振蕩 15 min，即為10-1稀釋度，根據(jù)含菌量用無菌水進行梯度稀釋，取稀釋后菌液200 μL涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行過夜培養(yǎng)。統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿的菌落數(shù)，計算平均1 g根際土壤的含菌量。試驗時以釋放后1 h回收的細菌數(shù)量為初始接種量。

1.2.3.6 數(shù)據(jù)采集與分析 試驗數(shù)據(jù)通過Excel和SPSS進行分析與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 固氮菌GXGL-4A生長曲線分析

由圖1、圖2可知，固氮菌GXGL-4A在LB液體培養(yǎng)基(富氮)、A15液體培養(yǎng)基(無氮)中均能生長，但生長速度不同。在LB液體培養(yǎng)基(富氮)中生長迅速，接種后約1 h即進入對數(shù)生長期，并在測定時間內(nèi)其D600 nm一直增大；而在A15液體培養(yǎng)基(無氮)中細菌生長緩慢，接種后約10 h才進入對數(shù)生長期，約20 h達到生長最大值，之后其D600 nm逐漸減小。據(jù)此可知，在營養(yǎng)較豐富的條件下，固氮菌GXGL-4A生長迅猛，而在無氮條件下，固氮菌GXGL-4A雖也能生長，但增殖緩慢，這一結(jié)果表明，氮營養(yǎng)水平對固氮菌的生長至關(guān)重要。

2.2 固氮菌GXGL-4A促生作用分析

由表1至表3、圖3至圖9可知，試驗組玉米先玉335、寧玉721及水稻CBB23植株的株高、根長、根鮮質(zhì)量、植株鮮質(zhì)量等指標與對照組植株整體上差異明顯，固氮菌GXGL-4A對水稻CBB23的促生效果較2個供試玉米品種更好。

2.3 固氮菌GXGL-4A根際消長動態(tài)分析

從圖10可以看出，接種后1～15 d均可以從玉米植株根際土壤中檢測到標記菌，在封閉系統(tǒng)與開放系統(tǒng)內(nèi)，玉米根際土壤的標記菌數(shù)量變化趨勢基本一致，均先增加后減少，并且均在釋放1 d后達到最大值；在相同的接種濃度(1×107CFU/mL)下，封閉系統(tǒng)內(nèi)標記菌GXGL-4A的數(shù)量明顯高于開放系統(tǒng)，其原因可能是滅菌土內(nèi)的微生物數(shù)量較少，接種后，固氮菌GXGL-4A迅速占據(jù)玉米根際土壤生態(tài)位而成為優(yōu)勢種群，而在自然土內(nèi)微生物群落非常復(fù)雜，接種后，固氮菌GXGL-4A與土壤中的原始微生物進行生態(tài)位競爭，導(dǎo)致接種后標記菌數(shù)量低于滅菌土。

表1 不同處理下玉米品種先玉335的生物量

注：同列數(shù)據(jù)后不同大、小寫字母分別表示在0.01、0.05水平上差異顯著。下表同。

表2 不同處理下玉米品種寧玉721的生物量

表3 不同處理下水稻品種CBB23的生物量

3 討論與結(jié)論

微生物的固氮作用在農(nóng)業(yè)增產(chǎn)中具有十分重要的意義。本研究表明，固氮菌GXGL-4A在營養(yǎng)較豐富的條件下生長迅速，在無氮條件下也可通過自身固氮作用利用空氣中的氮氣維持自身生長，它對玉米和水稻生長具有顯著促生作用，整體上來看，施加固氮菌后的供試植株在株高、根長、根鮮質(zhì)量及植株鮮質(zhì)量等方面較對照植株生物量明顯提高。在一定濃度范圍內(nèi)，其促生作用隨菌液濃度的增加而增強，尤其是根系表現(xiàn)最為明顯，固氮菌GXGL-4A能在根際土壤中迅速定殖并成為優(yōu)勢種群，推斷其促生作用主要是通過根部定殖來實現(xiàn)的。

先前已有一些關(guān)于植物根際促生菌(plantgrowth promoting rhizobacteria，簡稱PGPR)的研究，主要集中在PGPR菌株的篩選、入侵機制以及促生機制等方面[11-13]，研究結(jié)果表明，PGPR可通過固氮、解磷及產(chǎn)生植物生長調(diào)節(jié)劑等方式來促進植物生長[14-17]。對固氮菌的定殖觀測表明，固氮醋酸桿菌能從根尖和側(cè)根發(fā)生的周圍侵染植物[18]，而固氮螺菌能在根表與皮層之間的周質(zhì)空間內(nèi)定殖[19]。雖然固氮菌所固定的氮素供給植物的很少，但細菌死亡后釋放的有機氮能逐步被植物吸收利用，此外，固氮菌可以分泌許多有機酸使植物根際pH值下降，使難溶性礦物質(zhì)變得易溶，從而促進植物根系對各種營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進而間接促進植物生長[20-21]。

本研究聚焦于固氮菌GXGL-4A的固氮促生作用，在后續(xù)研究中，將借助現(xiàn)代分子生物學技術(shù)進一步探究其固氮促生機制并對其進行遺傳改造，使其具有更強的適應(yīng)能力和固氮能力，甚至開發(fā)成可施性生物肥料，應(yīng)用前景廣闊。

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