豬感染PRRSV后Cathelicidins抗菌肽基因的表達情況

盧艷敏

(衡水學院生命科學系，河北衡水 053000)

抗菌肽是動物天然免疫反應的重要組成部分，具有廣譜抗菌活性，對細菌、真菌、原蟲和病毒均具有較強的殺傷作用[1]，另外還可以抗癌、促進傷口愈合，因此具有較大的藥用開發價值。抗菌肽是生物體經誘導產生的具有抗菌活性的小分子多肽，在機體抵抗病原入侵中起著重要作用[2]，具有分子量小、抗菌譜廣、抗菌活性高、不易使病原菌產生耐藥性、不破壞動物體細胞、無免疫原性等優點。抗菌肽作用機制獨特，主要有膜作用機制和胞內作用機制。最新研究表明，抗菌肽還存在其他的殺菌機制，Chu等研究發現，抗菌肽α-defensin 6可以結合到鼠傷寒沙門氏菌表面，通過自我組裝，在細菌周圍形成一些小纖維和納米樣纖維，從而減少細菌黏附到腸道黏膜，以達到保護機體的目的[3]。汪以真發現，豬源hepcidin能夠使大腸桿菌K88聚集成團，形成網狀結構包裹[4]。

豬源抗菌肽主要包括防御素(defensins)和cathelicidins兩大家族，目前已發現了約30種豬源抗菌肽，其中Cathelicidins有PR-39、PG1-5(protegrin)、PF1-2(prophenin)和PMAP等4類抗菌肽[1]。cathelicidins基因由4個外顯子和3個內含子組成，1～3個外顯子編碼N-端信號肽區域(PRE)和保守的cathelin區域(PRO)，第4個外顯子編碼Pro區的最后幾個殘基和高度特異的C-端成熟肽區域。與其他抗菌肽相比，cathelicidins家族的抗菌活性更強[5-6]，抗菌作用迅速[7]，對耐藥菌株也具有較強的活性[8]、低的溶血活性以及細胞毒性，在新型抗菌藥物開發領域顯示出巨大的潛力[9]。

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是豬的一種高度傳染性疾病，最早在北美洲和歐洲發現，我國于1955年首次分離到豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)。PRRSV可引起妊娠母豬流產、死胎、木乃伊胎及產弱仔等繁殖障礙，并可引起各年齡階段豬的呼吸道癥狀，仔豬死亡率高，同時還會導致免疫抑制和持續性感染等癥狀。PRRSV對我國乃至世界養豬業造成了巨大的經濟損失，已成為嚴重威脅養豬業發展的重要傳染病之一，而現有疫苗及藥物效果均不理想[10]。本試驗主要研究豬感染PRRSV后體內cathelicidins抗菌肽的表達情況，為PRRSV新藥物的開發提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 PRRSV由國家野生動物疫病研究中心保存，PRRSV感染1月齡無特定病原體(SPF)豬(24頭)，分別于感染后12、24、72、168 h取樣(以未感染病毒的1月齡SPF豬6頭作為對照)，取肺臟、肺門淋巴結、脾臟、肝臟、骨髓等組織，將樣品置于凍存管中，液氮速凍，-80 ℃保存。

1.1.2 試劑 超純RNA提取試劑盒(Ultrapure RNA Kit)，購自北京康為世紀生物科技有限公司；SupermoⅢM-MLV反轉錄酶，購自北京百泰克生物技術有限公司；dNTP Mixture、Ribonuclease Inhibitor和Oligo(dT)18Primers，購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)；TransStart Green qPCR SuperMix，購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成 采用超純RNA提取試劑盒(Ultrapure RNA Kit)取凍存組織進行總RNA提取，操作過程按照試劑盒說明書進行。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量，紫外分光光度計下測定RNA濃度，隨后進行反轉錄，合成cDNA第一鏈。以合成的cDNA作為Real-Time PCR(即實時定量PCR)分析的模板，-20 ℃保存備用。

1.2.2 Real-Time PCR Real-Time PCR(實時定量PCR)引物(由上海英駿生物技術有限公司合成)序列[1，11]見表1，按照北京全式金生物技術有限公司TransStart Green qPCR SuperMix說明書進行Real-Time PCR，反應體系：P10.5 μL，P20.5 μL，2×TransStartTMGreen qPCR SuperMix 12.5 μL，Passive Reference Dye 0.5 μL，模板1.0 μL，ddH2O 10.0 μL。反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個循環。相對定量分析參照2-ΔΔCT法[12]。實時定量PCR分析共進行3次生物學重復。

表1 Cathelicidin引物序列

2 結果與分析

2.1 PR39的表達情況

豬感染PRRSV之后，在脾臟、肺、肺門淋巴結中均檢測到PR39的表達，且隨著感染時間的增長，表達量也有所變化。如圖1所示，豬感染PRRSV后，PR39在脾臟中的表達量在 0.5、1、3和7 d的4個感染時間段中，感染1 d后表達量最高，其次為感染0.5 d；豬感染PRRSV后，PR39在肺中的表達量在0.5、1、3和7 d的4個感染時間段中，感染1 d后表達量最高，其次為感染3 d；豬感染PRRSV后，PR39在肺門淋巴結中的表達量在0.5、1、3和7 d 4個感染時間段中，在感染1 d后表達量最高，然后依次是感染0.5、3、7 d，但感染0.5 d和 3 d 后的表達量差異不大。

綜上所述，豬感染PRRSV后，PR39在肺、肺門淋巴結和脾臟3種組織中的表達量均呈現先升高后降低的趨勢，且都是在感染1 d后表達量達到最高值。

2.2 Progerin 1的表達情況

豬感染PRRSV之后，在脾臟、肺、肺門淋巴結中均檢測到Progerin1(PG1)的表達，感染時間不同，其表達量有所變化，但差異較小。如圖2所示，豬感染PRRSV后，Progerin1在脾臟中的表達量在0.5、1、3和7 d 4個感染時間段中，在感染 1 d 后表達量最高，其次為感染0.5、7、3 d；豬感染PRRSV后，Progerin1在肺中的表達量在0.5、1、3和7 d 4個感染時間段中，在感染1 d后表達量最高，其次為感染3、7、0.5 d；豬感染PRRSV后，Progerin1在肺門淋巴結中的表達量在0.5、1、3和7 d 4個感染時間段中，在感染1 d后表達量最高，然后依次是感染0.5、3、7 d。綜上所述，豬感染PRRSV后，Progerin1在脾臟、肺和肺門淋巴結3種組織中的表達量均呈現先升高后降低的趨勢，且都是在感染1 d后表達量達到最高值，Progerin1的表達量在3種組織中的變化均不明顯。

2.3 progerin 1-5的表達情況

豬感染PRRSV后，在脾臟、肺、肺門淋巴結中均檢測到Progerin1-5(PG1-5)的表達，在脾臟中表達量較高，而在肺與肺門淋巴結中表達量較少，隨著感染時間的增長，表達量也有所變化。如圖3所示，豬感染PRRSV后，progerin1-5在脾臟中的表達量在0.5、1、3和7 d 4個感染時間段中，在感染 1 d 后表達量最高，然后依次為0.5、7、3 d；豬感染PRRSV后，progerin1-5在肺中的表達量在0.5、1、3和7 d 4個感染時間段中，在感染1 d后表達量最高；豬感染PRRSV后，progerin1-5在肺門淋巴結中的表達量在0.5、1、3和7 d 4個感染時間段中，在感染1 d后表達量最高，然后依次是感染0.5、3、7 d，但感染3 d與7 d后的表達量差異不大。

綜上所述，豬感染PRRSV后，progerin1-5在脾臟、肺和肺門淋巴結3種組織中的表達量均呈現先升高后降低的趨勢，且都是在感染1 d后表達量達到最高值，其中在脾臟中的表達量變化較大，而在肺中的表達量變化不明顯。

2.4 PMAP23的表達情況

豬感染PRRSV之后，在脾臟中未檢測到PMPA23的表達，肺、肺門淋巴結中檢測到PMPA23的表達，且隨著感染時間的增長，肺、肺門淋巴結中PMAP23的表達量有所變化。如圖4所示，豬感染PRRSV后，PMAP23在肺、肺門淋巴結中的表達量在0.5、1、3和7 d 4個感染時間段中，在感染1 d后表達量最高，然后依次為感染0.5、3、7 d。

綜上所述，豬感染PRRSV后，PMAP23在肺、肺門淋巴結中的表達量均呈現先升高后降低的趨勢，且都是在感染1 d后表達量達到最高值。

3 討論

抗菌肽分子量小，大部分具有12～50個氨基酸，具有強堿性、熱穩定性以及廣譜抗菌性等特點，在農業、醫藥等領域受到廣泛的重視，全球科研人員對抗菌肽的作用機制、藥物療效、安全性等進行了深入的研究，并且建立了抗菌肽數據庫(APD：http：//aps.unmc.edu/AP/main.php)[13]。目前，該數據庫已收錄2 700多種抗菌肽，其中272種抗菌肽來源于細菌，4種抗菌肽來源于古細菌，8種抗菌肽來源于原生生物、13種抗菌肽來源于真菌，335種抗菌肽來源于植物，2 043種抗菌肽來源于動物。這些抗菌肽具有抗細菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲、抗癌、抗原蟲等活性。

研究發現，多種抗菌肽具有抗病毒活性，如抗艾滋病病毒、皰疹病毒。LL-37是人體內唯一的cathelicidins，通過直接的滅活試驗發現，LL-37可以顯著降低幾種病毒對人的感染[14-17]。動物抗菌肽通過與病毒糖蛋白或細胞表面的病毒受體的相互作用，可以直接抑制病毒的感染，也可以通過激活其他抗病毒反應來間接地抑制病毒感染[18]。

本試驗測定了PRRSV在感染豬后的不同時間段內，脾臟、肺、肺門淋巴結中cathelicidins表達量的變化情況。研究結果表明，PR39、PG1、PG1-5、PMAP23的表達受到PRRSV的影響，豬感染PRRSV后，脾臟、肺、肺門淋巴結中的PR39、PG1、PG1-5、PMAP23表達量上調，其中PRRSV對PR39與PG1-5表達量的影響較大。下一步工作合成PR39、PG1、PG1-5、PMAP23多肽，測定抗菌肽對PRRSV的滅活效果以及對細胞的毒性，為PRRSV新藥物的開發提供新的思路。

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