三種內(nèi)阿米巴原蟲巢式多重PCR檢測方法

， ， ， ， ， ， ， 文超*

(1.安徽科技學院 動物科學學院，安徽 鳳陽 233100；2.六安市動物疫病預防與控制中心，安徽 六安 237000)

溶組織內(nèi)阿米巴(E.histolytica) 又稱痢疾阿米巴，是目前唯一已確定具有致病性的內(nèi)阿米巴原蟲，全世界約有5 000萬人感染，每年導致10萬人死亡，其死亡率在原蟲寄生蟲病患者中僅次于瘧疾[1-4]。迪斯帕內(nèi)阿米巴(E.dispar)是與溶組織內(nèi)阿米巴形態(tài)相同，生活史相似的另一蟲種。全世界約有5億人感染內(nèi)阿米巴，其中很大一部分為迪斯帕內(nèi)阿米巴。莫氏內(nèi)阿米巴(E.moshkovskii)為一種非致病性的內(nèi)阿米巴原蟲，但經(jīng)常出現(xiàn)在人、鼠、非人靈長類等動物的糞便中。

從形態(tài)上看，E.histolytica的包囊或裂殖子階段與寄生于人或非人靈長類腸道的非致病性E.dispar和E.moshkovskii難以區(qū)分，因此傳統(tǒng)的鏡檢方法難以區(qū)分不同的阿米巴原蟲蟲種[5]。盡管可通過糞便培養(yǎng)后利用同工酶分析區(qū)分E.dispar和E.histolytica，但該方法周期較長，且對試驗設(shè)備的要求較高，難以普及應用[6]。因此，目前主要通過分子診斷方法對阿米巴原蟲進行種類鑒定和基因分型，常用的靶基因有HLY6基因、16SrDNA、30-kDa蛋白基因等，其中16SrDNA基因已成為區(qū)分阿米巴原蟲蟲種的重要靶基因[7-8]。鑒于國內(nèi)目前有關(guān)溶組織內(nèi)阿米巴、迪斯帕內(nèi)阿米巴和莫氏內(nèi)阿米巴的分子檢測方法報道較少，本試驗根據(jù)3種內(nèi)阿米巴原蟲16SrDNA基因序列，建立一種能夠檢測上述3種內(nèi)阿米巴原蟲的巢式PCR方法，為其分子檢測和防控提供簡便可靠的技術(shù)工具。

1 材料與方法

1.1 蟲體及基因組DNA

E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii包囊和滋養(yǎng)體均由實驗室收集、保存，其中3種內(nèi)阿米巴原蟲包囊分離自單獨感染上述阿米巴原蟲的食蟹猴糞便(經(jīng)鏡檢和3種阿米巴原蟲特異的PCR方法鑒定[4])；……