蛋白酶高產(chǎn)菌株的選育

霍明月

摘 要：用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆蛛x純化方法對(duì)土壤中產(chǎn)蛋白酶的菌株進(jìn)行篩選，再用紫外誘變的方法對(duì)土壤中的蛋白酶高產(chǎn)菌株進(jìn)行篩選，最后對(duì)得到菌株進(jìn)行形態(tài)、生理生化的鑒定。已知土壤中產(chǎn)蛋白酶的菌株會(huì)使含有蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基產(chǎn)生透明圈，透明圈直徑與菌落直徑的比值與菌株產(chǎn)蛋白酶量成正比。一般紫外誘變會(huì)使菌株發(fā)生正誘變。

關(guān)鍵詞：蛋白酶；誘變；芽孢桿菌

中圖分類號(hào)：S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20180133003

引言

蛋白酶是最重要的一種工業(yè)酶制劑，能催化蛋白質(zhì)和多肽水解，廣泛存在于動(dòng)物內(nèi)臟、植物莖葉、果實(shí)和微生物中。在干酪生產(chǎn)、肉類嫩化和植物蛋白改性中都大量地使用蛋白酶。皮革工業(yè)的脫毛和軟化已大量利用蛋白酶，既節(jié)省時(shí)間，又改善勞動(dòng)衛(wèi)生條件。蛋白酶還可用于蠶絲脫膠、肉類嫩化、酒類澄清[1]。臨床上可作藥用，如用胃蛋白酶治療消化不良，用酸性蛋白酶治療支氣管炎，用憚性蛋白酶治療脈管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶對(duì)外科化膿性創(chuàng)口的凈化及胸腔間漿膜粘連的治療。由于動(dòng)植物資源有限，工業(yè)上生產(chǎn)蛋白酶制劑主要利用枯草桿菌、棲土曲霉等微生物發(fā)酵制備。因此，選育出蛋白酶高產(chǎn)菌株至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)以樹林土壤中篩選得到的蛋白酶生產(chǎn)菌株為出發(fā)菌株，采用紫外線照射誘變方法育種，篩選得到高產(chǎn)蛋白酶菌株。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基配置與滅菌

配置2瓶200mL1.8%瓊脂培養(yǎng)基和2瓶250mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

取7只試管，每支試管加9mL水，加塞濕熱滅菌。取10個(gè)平皿，用報(bào)紙包成1包，干熱滅菌。取1個(gè)三角瓶，裝入90mL水，加塞濕熱滅菌。

1.2 菌株分離篩選

無菌制平板。融化培養(yǎng)基，加入牛奶40mL，倒平皿，每組6皿，貼好標(biāo)簽。

制備菌懸液。取土樣10g倒入90mL水中，振蕩，靜置30s，上清液為菌懸液。

菌液10倍梯度稀釋。1mL菌液加入9mL水中，混勻，吸取稀釋的菌液再加入到新9mL水中，混勻；以此類推，制備10倍梯度稀釋。

涂布法將菌接種于平板上和培養(yǎng)。分別取10-5、10-6、10-7的菌液各100μL，倒置于30℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)2d。

1.3 記錄分離結(jié)果和菌株純化

觀察各平板的菌落周圍情況，對(duì)有透明圈的菌落進(jìn)行編號(hào)；測(cè)定透明圈直徑和菌落直徑，作好記錄；計(jì)算透明圈直徑（H）與菌落直徑（C）的比值；選取H/C比值較大的4株菌分別進(jìn)行下一步純化。

菌落純化。融化培養(yǎng)基，加入牛奶40mL，倒平皿，每組4皿，貼好標(biāo)簽（Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3、Ⅱ-4）；挑取H/C比值較大的菌落進(jìn)行平板劃線（分區(qū)劃線法），倒置于30℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。

1.4 培養(yǎng)基配置與滅菌

配置1瓶200mL1.8%瓊脂培養(yǎng)基。

取12支試管，每支試管加9mL水，加塞濕熱滅菌。取10個(gè)平皿，用報(bào)紙包成1包，干熱滅菌。取1個(gè)三角瓶，裝入250mL水，加塞濕熱滅菌。

1.5 紫外誘變

1.5.1 制備菌懸液

取出純化后的平皿，在平皿中加入蒸餾水2mL，用無菌涂布棒刮取菌苔，移液器取出菌液至無菌試管中，反復(fù)沖洗菌苔，一并轉(zhuǎn)移至無菌試管中。直至體積達(dá)15mL，用移液器吸打混勻懸浮菌體，至單細(xì)胞懸液。

1.5.2 對(duì)照組的稀釋涂布

吸取1mL菌液加入9mL水的試管中，進(jìn)行10倍梯度稀釋，作為對(duì)照（未經(jīng)紫外照射），分別取10-6、、10-7的菌液各100μL，均勻涂布于牛奶平板上，倒置于30℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。

1.5.3 紫外誘變

剩下的菌液14mL加入1無菌大頭針，并置于磁力攪拌器上，攪拌混勻懸浮；打開紫外燈預(yù)熱20min后，用15W紫外燈進(jìn)行照射處理2min，打開皿蓋計(jì)時(shí)（需在黑暗條件下操作）。

1.5.4 實(shí)驗(yàn)組的稀釋涂布

取照射2min的菌液1mL，加入9mL水的試管中，進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別取10-4、、10-5的菌液各100μL，均勻涂布于牛奶平板上，倒置于30℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。

1.6 觀察與記錄誘變結(jié)果

觀察測(cè)量對(duì)照處理的菌落透明圈，測(cè)定透明圈直徑和菌落直徑；計(jì)算透明圈直徑（H）與菌落直徑（C）的比值；分析結(jié)果原因，挑選菌落，在斜面劃線。

1.7 細(xì)菌菌株鑒定

1.7.1 培養(yǎng)基制備

淀粉水解培養(yǎng)基：取1支三角瓶，配置100mL的營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉和可溶性淀粉0.2g/L培養(yǎng)基；明膠液化培養(yǎng)基：配置50mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯和明膠（8g）培養(yǎng)基，溶化后分裝到5支試管中，每支管6mL；半固體培養(yǎng)基：配置50mL半固體培養(yǎng)基，溶化后分裝到5支試管中，每支管6mL；三糖鐵培養(yǎng)基：配置50mL三糖鐵培養(yǎng)基，溶化后分裝到5支試管中，每只管8mL；乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基：配置50mL乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝到5支試管中，每支管6mL，加入1個(gè)杜氏小管；mR：配置50mL mR培養(yǎng)基，分裝到10支試管中，每支管5mL；vP：配置50mL mR培養(yǎng)基，分裝到10支試管中，每支管5mL；檸檬酸鹽培養(yǎng)基：配置50mL檸檬酸鹽培養(yǎng)基，溶化后分裝到5支試管中，每支管5mL。培養(yǎng)基121℃，15min濕熱滅菌，取出后擺斜面；葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基；蔗糖培養(yǎng)基；棉籽糖培養(yǎng)基；山梨醇培養(yǎng)基；纖維二糖培養(yǎng)基；水楊苷培養(yǎng)基；淀粉水解培養(yǎng)基。

1.7.2 進(jìn)行菌株鑒定并觀察與記錄結(jié)果

半固體穿刺：穿刺接種，培養(yǎng)后觀察有無鞭毛結(jié)構(gòu)。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面：斜面劃線，培養(yǎng)后進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，觀察菌落特點(diǎn)。

革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染4個(gè)步驟。

三糖鐵：穿刺后斜面劃線，培養(yǎng)后觀察顏色。

檸檬酸鹽：斜面劃線，培養(yǎng)后觀察顏色。

乳糖發(fā)酵：接種環(huán)劃菌（液體接種法），培養(yǎng)后觀察顏色。

明膠液化：接種環(huán)劃菌（液體接種法），培養(yǎng)后觀察顏色。

MR：接種環(huán)劃菌（液體接種法），培養(yǎng)后，加2滴甲基紅，觀察顏色。

VP：接種環(huán)劃菌（液體接種法），培養(yǎng)后，加2滴甲液后加2滴乙液，觀察顏色。

葡萄糖發(fā)酵，蔗糖培養(yǎng)基，棉籽糖培養(yǎng)基，山梨醇培養(yǎng)基，纖維二糖培養(yǎng)基，水楊苷培養(yǎng)基，淀粉水解培養(yǎng)基：液體接種法，培養(yǎng)后觀察顏色。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌菌株鑒定結(jié)果與分析

3 結(jié)論

紫外誘變后的產(chǎn)蛋白酶含量不高。本實(shí)驗(yàn)最后紫外誘變得到革蘭氏陰性菌、短桿菌、無芽孢。為此本組成員對(duì)存在問題討論，由于實(shí)驗(yàn)課程有限，本實(shí)驗(yàn)組成員對(duì)原因進(jìn)行了猜測(cè)：在測(cè)量菌落透明圈直徑和菌落直徑時(shí)存在誤差；紫外誘變的過程中出現(xiàn)操作性問題。

現(xiàn)今，蛋白酶已廣泛應(yīng)用在皮革、毛皮、絲綢、醫(yī)藥、食品、釀造等方面。因此，選育出蛋白酶高產(chǎn)菌株至關(guān)重要，本實(shí)驗(yàn)組將繼續(xù)研究蛋白酶高產(chǎn)菌株的選育問題，爭(zhēng)取最后得到目的菌株—蛋白酶高產(chǎn)的芽孢桿菌。

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