高寒森林溪流微生物群落結構的季節性變化

黃春萍, 吳福忠, 張 健, 岳 楷, 張 川, 楊萬勤,*

1 四川農業大學生態林業研究所,林業生態工程重點實驗室,成都 611130 2 四川師范大學生命科學學院,成都 610068

高寒森林溪流是高山森林生態系統的重要組成部分,不僅是眾多江河流域的水源源頭,也是陸地與水生生態系統物質與能量源/匯動態的重要紐帶,在自然環境演替、森林環境和物種分布格局中發揮著重要的作用[1-2]。溪流特有的時空變異,對鏈接物質循環和能量流動的微生物將產生深刻影響,從而調控相關的關鍵生態學過程。隨著全球氣候的變化,長江流域高山森林生態系統的敏感性和脆弱性逐漸增加[3],伴隨著雪被的減少、冬季溫度的降低以及土壤凍結和凍融交替的增強[4],更容易受到氣候變化影響的高寒森林溪流環境中的微生物群落將受到深刻的影響。但是,這方面目前尚缺乏必要的關注。

不斷增加的研究表明,高寒森林陸地生態系統中具有豐富的微生物,各類群微生物對季節性凍融均具有積極的響應。不但微生物數量和群落組成會發生變化[5],而且由于微生物形態、生長策略以及各自的生態位之間的較大差異,使得微生物各類群間對環境變化的耐受能力和養分動態的響應也存在不同,最終表現為冬季比生長季節具有更高的真菌/細菌比例[6-7]。與陸地生態系統相比,水生環境中的微生物數量、分布和活性不僅受到相似因子(如氣候和pH值等)的調控[8-9],而且還會受到溪流獨特環境因子的影響,比如相對穩定的溫度、充足的水源、低氧和強烈的沖刷作用等[10-12]。然而,有關水生生態系統(如溪流)中微生物群落結構和組成的研究報道較少,尤其是有關微生物群落在高寒森林陸地生態系統和水生態系統中的季節性變化異同鮮見報道。

川西高寒森林位于青藏高原東緣,是全球變化的敏感地帶,具有典型的季節性動態,環境條件隨冬季雪被的形成、覆蓋、消融及土壤的凍融循環過程而顯著改變,且在不同生境下差異明顯[2]。同時,作為我國第二大林區的主體,在調節區域氣候、涵養水源和生物多樣性保育等方面有著不可替代的作用和地位[6-7,13]。因此,本文以川西高寒森林為研究區域,結合同步溫度動態和水環境特征監測,對比研究了溪流(水體環境)和土壤(陸地環境)中微生物群落結構的季節性變化動態特征及其與溫度等環境因子之間的關系。本研究以期為進一步認識高寒森林土壤和水體生態過程及其季節轉換提供基礎資料和理論依據。

1 材料和方法

1.1 研究區域概況

本研究在四川省理縣高山森林生態系統定位研究站(102.53°—102.57°E,31.14°—31.19°N,海拔2458—4619 m)進行。研究站地處青藏高原東緣與四川盆地的過渡帶,年平均氣溫3℃,溫度波動范圍為-18—23℃,年降水量801—850 mm。研究區域的森林植被隨海拔由低到高依次為針闊混交林、高寒針葉林、高山灌叢和草甸。實驗樣地位于海拔3580 m的典型高寒森林,喬木層主要為四川紅杉(Larixmastersiana)、方枝柏(Sabinasaltuaria)、岷江冷杉(Abiesfaxoniana)。林下灌叢主要為康定柳(Salixparaplesia)和高山杜鵑(Rhododendronlapponicum)、三顆針(Berberissargentiana)、扁刺薔薇(Rosaweginzowii)等,草本主要是高山冷蕨(Cystopterismontana)、莎草屬(Cyperusspp.)和苔草屬(Carexspp.)植物[2,14-15]。在研究區高寒森林典型林冠下選取3個25 m×25 m的樣方,每個樣方相距1 km左右。同時,在鄰近林下樣地的區域分別選取3條典型的森林溪流。每條溪流長約為200 m, 寬30—160 cm。

1.2 樣品采集及理化特征檢測

基于前期相關研究,將一年劃分為5個關鍵時期,在2014年到2015年共兩年分10次采集樣品,即雪被形成初期I(Early stage of snow cover I,OF I)、雪被覆蓋期I(Peak of snow cover I,FP I)、雪被消融期I(Stage of snow thaw I,TP I)、生長季前期I(Early growth period I,EGP I)、生長季后期I(Later growth period I,LGP I)、雪被形成初期II(Early stage of snow cover II,OF II)、雪被覆蓋期II(Peak of snow cover II,FP II)、雪被消融期II(Stage of snow thaw II,TP II)、生長季前期II(Early growth period II,EGP II)和生長季后期II(Later growth period II,LGP II)。在各采樣點放置1個紐扣式溫度計(iButton DS1923-F5,Maxim/Dallas Semiconductor,Sunnyvale,USA),同步記錄采樣點環境溫度每兩小時變化情況(圖1)。

圖1 監測樣地和大氣日平均溫度動態(2013.11.13—2015.11.11)Fig.1 Dynamics of mean daily stream, soil and air temperature at each sample plot from 13 November, 2013 to 11 November, 2015

分別于每個時期末采集林下樣方有機層土壤,置滅菌的聚丙烯袋低溫帶回實驗室,-80℃(Wizard2.0型熱板真空冷凍干燥機 VirTis USA)冷凍干燥備用。用滅菌的安剖瓶采集表層10—20 cm的溪流水,低溫保存帶回實驗室。在每次采樣時即時測定采樣點水樣pH值和流速。取各水樣用滅菌的0.22 μm的微孔濾膜過濾,濾液用于檢測水溶性有機碳和溶解氧等[2]。濾膜-80℃冷凍干燥備微生物多樣性檢測用。

1.3 微生物多樣性

凍干土壤和水樣濾膜樣品的基因組DNA均采用北京天恩澤基因科技有限公司的Soil DNA out試劑盒并按操作說明提取。提取得到的微生物DNA呈棕色、灰白色或褐色,且含有較多有機質和腐殖酸。采用天根生化科技(北京)有限公司Universal DNA Purification Kit試劑盒純化所有的樣品DNA,純化步驟按試劑盒說明書進行。采用338f：5′-(GC)-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′ 和 518r：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′ 擴增細菌16S rDNA[16]。反應條件為：95℃ 預變性 3 min,95 ℃變性60 s,55 ℃退火50 s,72 ℃延伸60 s,35個循環,最后72℃延伸10 min。采用U1：5′-(GC)-GTGAAATTGTTGAAAGGGAA-3′ 和U2：5′-GACTCCTTGGTCCGTGTT-3′ 擴增真菌18S rDNA[17]。反應條件為：95℃預變性3 min,95℃變性60 s,56 ℃退火30 s,72 ℃ 伸60 s,35個循環,最后72 ℃延伸10 min。擴增體系均為25 μL體系,包括Premix Ex Taq 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,純化后的模板DNA(1—10 ng)1 μL,最后用ddH2O補足至25 μL。

細菌16S rDNA 和真菌 18S rDNA 擴增產物純化回收后分別進行變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)分析。條件為：8%聚丙烯酰胺凝膠,變性劑濃度為30%—60%。80 V恒壓和60 ℃恒溫下持續電泳16 h。電泳結束后,采用銀染法對DGGE凝膠進行染色[18],然后采用Bio-rad GelDoc XR System凝膠成像系統拍照。選擇凝膠上的差異條帶及共性條帶進行切膠回收和擴增,擴增產物純化后,連接到pMD19-T載體(TaKaRa),再轉入大腸桿菌感受態細胞DH5α在培養皿中進行培養,進行藍白斑篩選,將獲得陽性克隆進行測序。

同時,選擇測序后的陽性克隆并提取質粒供qPCR反應的標準曲線使用,質粒濃度采用ScanDrop100超微量核酸蛋白測定儀(Analytik Jena,德國)測定,然后分別進行10倍梯度系列稀釋以作為定量PCR擴增的標準品在Mini-Opticon Real-Time system (Bio-Rad, USA)上進行擴增,根據所得標準曲線計算得出樣品中的基因拷貝數,最后以每克樣品(干重)或每毫升水中的基因拷貝數為單位進行分析。PCR反應效率和標準曲線的相關系數分別為：細菌107.5%和r2= 0.998,真菌98.3% 和r2= 0.997。

1.4 數據處理與統計分析

DGGE圖譜采用Bio-Rad Quantity One軟件處理,樣品中條帶的位置和灰度分別類比于物種的種類和數量,對圖譜中的主要條帶進行灰度分析后,采用Canoco 4.5對分析得到的灰度值矩陣數據進行PCA分析。選擇Shannon-Wiener多樣性指數(H)表征群落結構狀態。

實時熒光定量PCR擴增得到的不同微生物基因拷貝數經過Ln對數轉換后進行統計分析,采用SPSS 17.0統計軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA),多重比較采用最小顯著差異法(LSD)。微生物基因豐度與環境因子的相關關系采用Pearson法分析。數據整理、計算與作圖均采用Microsoft Excel 2013軟件。

2 結果與分析

2.1 微生物rDNA豐度分析

熒光定量PCR結果顯示,溪流和森林土壤中凍融季節和生長季節均檢測到細菌 16S rDNA和真菌 18S rDNA且均表現出相應的季節性變化規律。在不同關鍵時期相同環境中的細菌16S rDNA豐度均顯著高于真菌18S rDNA豐度(P< 0.05)(圖2)。

圖2 溪流和森林土壤微生物rDNA豐度Fig.2 Abundance of stream water and forest soil microbiology rDNA OF I：雪被形成初期I Early stage of snow cover；FP I：雪被覆蓋期I Peak of snow cover I；TP I：雪被消融期I Stage of snow thaw I；EGP I：生長季前期I Early growth period I；LGP I：生長季后期I Later growth period I；OF II：雪被形成初期II Early stage of snow cover II；FP II：雪被覆蓋期II Peak of snow cover II；TP II：雪被消融期II Stage of snow thaw II；EGP II：生長季前期II Early growth period II；LGP II：生長季后期II Later growth period II； 不同小寫字母表示差異達0.05水平

溪流和森林土壤中細菌16S rDNA 豐度隨時間的變化波動不大,但是表現出不同的季節性變化規律。全年溪流中16S rDNA 豐度在生長季節前期顯著性高于其它時期(P<0.05),雪被消融期顯著性最低(P<0.05)；而森林土壤16S rDAN 豐度在雪被覆蓋期比生長季節高,但無顯著性差異(P>0.05)。溪流和森林土壤中真菌18S rDNA 豐度隨時間的變化與細菌16S rDNA 相似,但波動均不大。全年溪流中18S rDNA 豐度在生長季節前期較高,但無顯著性差異(P>0.05),雪被消融期最低,也無顯著性差異(P>0.05)；森林土壤18S rDNA 豐度在雪被覆蓋期比生長季節高,無顯著性差異(P>0.05)。

不同生境或者季節性變化的不同時期,真菌/細菌的比例會受到深刻影響(圖3),真菌/細菌比例在溪流環境中和森林土壤中的季節性變化特征相似,表現為冬季高于生長季節。但森林土壤真菌/細菌比在各個時期是溪流真菌/細菌比的約5—6倍。

圖3 溪流和森林土壤真菌 18S rDNA / 細菌 16S rDNA比例Fig.3 The radio of fungal 18S rDNA / bacterial 16S rDNA in the stream water and forest soil

2.2 微生物 PCR-DGGE 指紋圖譜分析

為了達到對結果的最佳分析,采用Quantity one 軟件對 DGGE 圖譜進行定量分析后,將DGGE圖轉化為更直觀的Compare lane images,即DGGE指紋圖譜(圖4)。從圖中可以看出微生物的類群、相對數量及其動態過程在不同環境的同一關鍵時期或者相同環境的不同關鍵時期均存在明顯差異,溪流水環境和森林土壤中各個時期均具有豐富的細菌多樣性和真菌多樣性。

為了進一步理解這種差異,對溪流和森林土壤細菌和真菌隨季節性變化的不同關鍵時期的群落組成分別進行了主成分分析(圖5)。分析顯示,溪流中,雪被形成初期的細菌群落結構與雪被覆蓋期相似；并與雪被消融期和生長季節(包括生長季前期和后期)分別具有明顯的差異,而雪被消融期和生長季節之間也具有較大的差異。森林土壤中,不同關鍵時期細菌群落結構之間的差異與溪流中的比較結果相似。另一方面,溪流中,凍融時期的真菌群落具有相似的結構,而與生長季前期和后期具有明顯的差異。同時,森林土壤中,生長季前期和雪被消融期的真菌群落結構與生長季后期、雪被形成初期及雪被覆蓋期具有明顯差異(圖5)。

從DGGE凝膠中切割分離了優勢條帶和大部分可見條帶,測序分析結果表明：溪流中的細菌類群以紅球菌屬(Rhodococcussp.)為主(條帶S16a,S16b,S16c,S16d,S16e和S16g)(圖4),占所測序條帶的約50%。溪流中的細菌類群在各個時期相對穩定,盡管數量上紅球菌屬較多,但是在各個時期均穩定且也占據優勢地位的是以條帶S16f為代表的菌群,序列比對結果顯示其同源性最高的為不可培養細菌,且同源性僅94%,與其同源性最近的已鑒定物種為Jatrophihabitanssp. I14A-00812(登錄號：KR184262.1)。與溪流相比,森林土壤細菌類群則以芽孢桿菌屬(Bacillussp.)比例相對較高(條帶F16a,F16b,F16c,F16d,F16e和F16f)(圖4),占所測序條帶的約30%,溪流水環境中的優勢細菌紅球菌在森林土壤中僅少量檢測到(條帶F16g,F16h和F16i)。溪流中的真菌類群以曲霉屬(Aspergillussp.)(條帶S18a,S18b和S18c)和空團菌屬(Cenococcumsp.)(條帶S18d和S18e)為主(圖4),其中空團菌屬在各個時期均占據優勢地位,且空團菌屬的其中一個類群(條帶S18e)在溪流各個時期所占比例均較高。與溪流相比,森林土壤的真菌類群更加豐富,格孢菌屬(Pleosporalessp.)(條帶F18a,F18d和F18e)、曲霉屬(條帶F18f和F18h)和其他一些子囊菌門(Ascomycota)的類群(條帶F18b,F18c和F18g)在各個時期穩定存在并占據優勢地位(圖4)。

選擇Shannon-Wiener多樣性指數(H)來表征溪流和森林土壤微生物群落結構狀態,無論是細菌群落結構還是真菌群落結構均表現出其獨特的季節性變化特征,且兩年的特征相似,見表1。溪流細菌多樣性指數在各個關鍵時期均較森林土壤低,而兩個環境均表現出相似的季節性變化特征,從雪被形成初期到雪被覆蓋期逐漸降低,進入生長季節后又逐漸增加。溪流真菌多樣性指數在各個關鍵時期也較森林土壤低,但是季節性變化特征不同。溪流真菌多樣性指數從雪被形成初期開始降低,而從雪被消融期到生長季節開始升高,在生長季前期達到全年最高。而森林土壤真菌多樣性指數則表現出較小的波動,從雪被形成初期開始降低,而從雪被覆蓋期到雪被消融期開始升高,并達到全年最高,進入生長季節又開始降低。

2.3 微生物豐度與環境因子的相關性

采用SPSS 17.0軟件對溪流和森林土壤中的微生物豐度與相應的環境因子進行Pearson 相關性分析,結果見表2。溪流細菌豐度與正積溫(P= 0.634)、溶解氧(P= 0.473)和水溶性有機碳(P= 0.621)呈極顯著正相關(P<0.01),與pH值(P= -0.442)呈顯著負相關(P<0.05)；溪流中真菌豐度僅與水溶性有機碳(P= 0.390)呈顯著正相關(P<0.05)。另一方面,森林土壤細菌豐度與日均溫(P= -0.489)和正積溫(P=-0.409)呈極顯著負相關(P<0.01),真菌豐度則與水溶性有機碳(P= -0.471)呈極顯著負相關(P<0.01)。

圖4 溪流和森林土壤微生物DGGE 指紋圖譜Fig.4 DGGE profile of the microbial community in the stream water and forest soil

圖5 溪流和森林土壤微生物群落結構的PCA分析Fig.5 The PCA analysis of the microbial community in the stream water and forest soil

3 討論

微生物是生態系統的重要生命體,參與生態系統物質循環與能量轉換,在不同的生態系統中維持著相應的生態系統功能及其穩定性[5,19]。研究通過以土壤(陸地環境)作為對比,研究了高寒森林溪流(水體環境)中微生物群落結構的季節性變化動態特征及其與環境因子之間的關系。

與前期在該區域的研究結果一致[6-7,20],季節性凍融直接影響林下土壤微生物群落結構,表現出冬季比生長季節更高的微生物豐度和多樣性。但是越來越多關于水生環境中微生物群落結構的研究表明區域性環境因子具有更顯著的作用[21]。流動水環境相對土壤的強烈沖刷作用,直接影響其中水體生物的活動[10]。與此同時,高寒森林水生環境還普遍存在微環境氣候、水流、水溫、凍融等控制了水-氣界面微環境特征[22-23],而且雪被形成、覆蓋和消融以及土壤凍融過程也會直接改變森林溪流水體環境[14],這些都會對水體中微生物群落產生深刻的影響。本研究顯示,空間差異性大且營養物質相對低的溪流中,微生物豐度和多樣性指數相對較低,其中細菌豐度在不同時期表現出顯著差異(P<0.05)。盡管溪流溫度波動較土壤溫度波動小,但是溫度也能支配微生物的數量、分布和活性[10-11,24]。本研究發現細菌豐度波動在溪流中比在土壤中大,而真菌豐度波動在溪流和土壤中相差不大。這也說明了在不同生境中溫度及其波動范圍可能引起微生物類群的不同響應,反映了細菌比真菌更易受到溫度影響的特點[25],尤其是在冷水水域[10]。

表1 溪流和森林土壤微生物群落Shannon-Wiener 指數Table 1 Shannon-wiener diversity indexes of microbial community in the stream water and forest soil

OF I：雪被形成初期I Early stage of snow cover；FP I：雪被覆蓋期I Peak of snow cover I；TP I：雪被消融期I Stage of snow thaw I；EGP I：生長季前期I Early growth period I；LGP I：生長季后期I Later growth period I；OF II：雪被形成初期II Early stage of snow cover II；FP II：雪被覆蓋期II Peak of snow cover II；TP II：雪被消融期II Stage of snow thaw II；EGP II：生長季前期II Early growth period II；LGP II：生長季后期II Later growth period II

表2 微生物多樣性與環境因子之間的Pearson相關性分析Table 2 Pearson′s correlation analyses between microbial diversity and environmental variables in the stream and the forest soil

* 表示顯著相關 (P< 0.05), **, 表示極顯著相關 (P< 0.01);a因為溪流凋落葉中負積溫在各個時期均為0,因此變量為常量,無法計算

已有研究表明微生物的生長與可溶性有機碳密切相關[26]。季節性變化過程中,隨著冬季凍融循環溫度降低,溪流水中可溶性有機碳濃度降低,微生物豐度隨之降低；而隨著生長季節的到來,溫度升高,可溶性有機碳濃度升高,微生物豐度也升高。這與大量水生生境中有關微生物生物量或豐度變化的研究結果一致。相關性分析也表明細菌和真菌豐度與可溶性有機碳存在極顯著或顯著的正相關性(表2,P< 0.01或P< 0.05)。同時,細菌和真菌形態、生長策略以及生態位的差異可能導致了細菌和真菌對養分動態的響應存在差異,這些差異將引起其群落結構的動態變化差異,再加上真菌較細菌更可能具有更高的碳固定能力[27],因此無論水生環境還是陸生環境冬季較生長季節高的真菌/細菌比例對冬季生態系統碳氮周轉具有非常重要的意義。

除了溫度和可溶性有機碳,pH值、光照和水流,以及溶解氧等其他營養物質都會深刻影響溪流水環境中的微生物活性、群落結構及其組成[8-10]。本研究通過分析優勢類群發現,紅球菌屬在溪流環境中占顯著的優勢地位,隨著季節性變化,溪水中含氧量發生改變,好氣性的紅球菌類群及其相對的比例在含氧量高的生長季節更高,并且各個時期變化較大。而森林土壤中,紅球菌屬的種類和數量均較溪流中低,這可能是由于森林土壤更容易受到季節性變化的深刻影響,而導致更耐極端環境的芽孢桿菌迅速占據優勢地位,這一特點尤其表現在土壤凍融循環頻繁,溫度較低的冬季。另一方面,分析真菌優勢類群結果表明,與真菌類群豐富的森林土壤相比,溪流真菌優勢類群明顯較少。相對于細菌,真菌途徑為慢周轉方式,偏好低營養和難分解的高碳氮比的有機物,底物循環時間相對較長[28-29],因此,溪流中真菌群落結構相比細菌或者土壤中的真菌更容易受到營養物質相對貧瘠的溪流區域性環境因子的深刻影響,因此也表現出全年較大的多樣性指數波動。

4 結論

高寒森林溪流微生物豐度和多樣性均較低,并表現出明顯的季節性變化特征,且冬季較生長季節具有更高的真菌/細菌比,細菌和真菌優勢類群的比例均隨季節性變化發生改變。季節性變化和冬季凍融循環對溪流環境中的微生物群落結構和多樣性均產生不同程度的影響,期間,溫度、pH、水溶性有機碳和溶解氧等環境因子對微生物結構和多樣性變化具有重要作用。本研究為深入研究高寒森林水體和土壤生態過程及其季節轉換提供了一定的基礎資料和理論依據。

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