不同種源五角楓幼苗葉片N、P化學計量學特征對氮添加的響應

宋沼鵬, 何念鵬, 侯繼華,*

1 北京林業大學森林資源與生態系統過程北京市重點實驗室, 北京 100083 2 中國科學院地理科學與資源研究所生態系統網絡觀測與模擬重點實驗室, 北京 100101

由于化肥和化石燃料的大量使用,越來越多的氮素輸入到自然生態系統[1-2]。氮素對自然生態系統的影響以及生態系統的響應受到越來越多的關注。氮素作為植物生長必需的基本營養元素,氮沉降可以改變土壤化學性質、植物的生長、種間競爭、凋落物分解和其他的生態系統過程[3-4]。在氮素缺乏的森林生態系統中,適量的氮沉降能夠促進該系統中植物的N吸收效率和光合能力和固碳能力[5],進一步提高林地生產力[6-7]。但是,當過多的氮素被植物吸收,植物體內出現氮飽和的時候,使得植物體內碳分配格局發生變化,抑制光合速率[8]。同時,外界環境持續的高氮沉降,會使樹木因缺乏鹽基陽離子而降低生產力,最終死亡[9-10],從而導致生物多樣性降低,減弱生態系統的功能[11]。因此,植物在不同氮沉降濃度條件下是如何進行響應的,是全球氮沉降對森林生態系統影響的重要課題,仍然是現階段森林生態學科研究的重點問題。

對于分布廣泛的植物物種而言,不同的地方種群長期適應不同的生活環境,形成不同的生態型,這是植物對環境適應的結果[12]。氮沉降過程中,氮素通過多種途徑沉降到土壤中,而土壤環境的改變將會直接導致植物的適應策略發生改變[13]。從理論來講,不同的生態型植物對氮沉降的適應特點也會呈現區域差異。但是到目前為止,不同地區種源個體對氮沉降生態響應策略的變化受到的關注較少。大氣環境氮素沉降增加導致土壤氮供給量的改變已經成為影響森林生長和穩定的重要生態因素[14-17]。因此,研究同一物種的不同種源個體對氮沉降的響應是揭示植物對氮沉降響應的有效途徑,能夠更加深入的了解植物對氮沉降的適應機制,也能夠對該物種在不同生長地區的適應策略有更加直觀的認識和區分。

五角楓(Acermono)是我國暖溫帶落葉闊葉林分布廣泛的常見物種,具有較高的表型多樣性以及遺傳多樣性,對環境適應能力比較強[18-22]。姚婧[20]通過研究不同林型五角楓葉性狀異速生長關系發現不同發育階段五角楓資源利用方式不同。葉片作為植物制造有機物的重要器官,其功能性狀必然對環境的變化極為敏感,土壤環境條件的變化可以使葉片的形態以及化學計量發生變化,從而植物則會調整其自身的資源配置,以適應環境的變化[23-24]。本實驗選擇北京、山西、內蒙古地區具有明顯遺傳多樣性[22]的五角楓幼苗進行氮添加處理,研究其主要葉片功能性狀以及N、P化學計量學特征對不同濃度氮添加的響應機制,試圖回答以下科學問題：(1)在氮添加條件下,不同種源的五角楓幼苗的各葉片功能性狀以及N、P化學計量學特征對不同氮添加水平如何響應；(2)這種響應趨勢是否具有種源差異；(3)響應的差異是否會導致各種源的五角楓幼苗資源利用策略的改變。

1 研究材料與方法

1.1 研究地區自然概況

研究地點位于山西省長治市沁源縣靈空山自然保護區國家林業局太岳山森林生態系統定位站(112°07′E,36°38′N)。該地區屬暖溫帶大陸性季風氣候,四季分明春季干旱多風,夏季降水集中,年均溫在9.3—12.3℃,年均降雨量662mm(7、8、9月雨量集中,超過全年降雨量的60%),年均相對濕度60%—65%,年均日照2600h,年平均無霜期110—125d。土壤多為褐土和棕壤。森林類型主要以暖溫帶落葉闊葉林為主[25-26]。

1.2 試驗材料

選取北京(BW)、山西(SW)、內蒙古(NW)3個種源的3年生五角楓移栽幼苗為試驗對象。幼苗分別選自北京風沙源育苗中心、山西省太岳山靈空山林場、內蒙古赤峰市松山區安林苗圃,從當地天然林區收集種子經人工培育而成[27]。

1.3 氮添加水平的設置

中國自然的氮沉降呈現從東南到西北遞減的梯度。對五角楓幼苗進行模擬氮沉降的控制實驗也必須遵循自然條件下的氮沉降水平。監測數據表明,近年來內蒙古地區的氮沉降約為20kg hm-2a-1,北京地區約為30kg hm-2a-1,山西地區約為40—45kg hm-2a-1[28]。根據不同地區的氮沉降量,同時參照北美Harvard Forest的高濃度氮添加實驗[29]以及Bobbink等的低濃度氮添加實驗[30],本研究設置對照(N0,0kg hm-2a-1)、低氮(N1,15kg hm-2a-1)、中氮(N2, 25kg hm-2a-1)、高氮(N3, 50kg hm-2a-1)、超高氮(N4, 150kg hm-2a-1) 5個氮添加梯度。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗設計

圖1 不同種源五角楓氮添加實驗樣地設計圖(引自蔣思思 [27])Fig.1 The design plot of different provenances Acer mono under nitrogen deposition experimental[27]N0:對照,0kg hm-2 a-1; N1:低氮,15kg hm-2 a-1;N2:中氮,25kg hm-2 a-1;N3:高氮,50kg hm-2 a-1;N4:超高氮,150kg hm-2 a-1N0:Control,0kg hm-2 a-1; N1: low nitrogen,15kg hm-2 a-1;N2: middle nitrogen,25kg hm-2 a-1;N3:high nitrogen,50kg hm-2 a-1;N4:the supersaturated nitrogen,150kg hm-2 a-1

在太岳山森林生態系統定位站以南200m,選取合適大小為(10m×20m)的平坦試驗樣地。由于實驗設計為5—6年的氮添加實驗,而最初種植時五角楓幼苗根系長度小于20cm,故50cm的原土深度滿足實驗要求。首先移除樣地內深50cm的土壤,將取自林區林下的土壤過篩、充分混勻后,回填到樣地內。林下土壤的有機質含量為(20.91±2.30)g/kg,全氮含量為(1.15±0.03)g/kg,全磷含量為(0.61±0.02)g/kg。幼苗的栽種密度參照劉史力油松人工林幼苗撫育實驗[31],人工林種植密度滿足10株/10m2,幼苗株間距定為50cm。因此在滿足實驗重復的前提下,設置每個小樣方面積為3m×3m。樣地進一步劃分為15個3m×3m的小樣方,小樣方間隔1m。為了避免相鄰樣方的植物根系受不同的氮添加水平影響,小樣方之間用石棉瓦隔開,石棉瓦深度為50cm,具體樣地設計圖見圖1。2011年10月將3個不同種源的五角楓幼苗做好標記后,移栽至樣地內隨機混植,每個小樣方中每個種源的幼苗各6株,株間距為50cm。

自2012年6月起,每月將相應質量的NH4NO3溶于3L水中再分別向每個小樣方中的地面均勻噴施(N0處理噴施等量的水,樣地中其他的水均來源于自然降雨)。

1.4.2 樣品采集

2015年9月底,在每個小樣方內隨機選取3個種源的五角楓幼苗各3株進行樣品采集,即每個氮添加水平下每個種源的五角楓幼苗共9株作為重復。采集每株五角楓幼苗接近頂端的倒數第3枝條,枝、葉進行分離,葉片裝入自封袋中稱量鮮重并于當天測量葉面積,擦凈葉片,剪掉葉柄,將每株所采葉片用HP Scanjet G3110掃描儀進行掃描,用ImageJ軟件計算葉片的葉面積,之后在80℃的溫度下烘干24h至恒重,稱其干重,并測定氮磷化學計量學指標。

1.4.3 主要功能性狀指標及氮磷化學計量特征的測定

葉片干物質含量LDMC/(g/kg)= 葉片干重/葉片鮮重,

LDMC變化量/(g/kg)= 各氮水平處理(N1、N2、N3、N4)的LDMC-N0的LDMC；

比葉面積SLA /(m2/kg)= 葉面積/葉干重,

SLA變化量/(g/kg)= 各氮水平處理(N1、N2、N3、N4)的SLA-N0的SLA。

將烘干的葉片進行研磨,過5mm篩,用分析天平稱取樣品5g,用硫酸紙送至消煮管底部,植物樣品的消煮采用H2SO4-H2O2消煮法,將消煮液過濾轉移入100mL容量瓶中,用蒸餾水定容保存,N、P的測定用Seal Analytical AA3(德國)連續流動分析儀。

氮、磷面積濃度(Narea, Parea) =氮、磷質量濃度(Nmass, Pmass)×單位面積的干物質含量。

1.4.4 數據處理

葉性狀數值由算術平均值和標準誤差來表示。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)來檢驗模擬氮沉降對植物功能性狀產生的影響,采用Fisher LSD法分析各性狀在不同處理間是否差異顯著(α=0.05)。用 Pearson 相關性分析計算葉片性狀間的相關性,雙因素(Univariate two-way)方差分析檢驗種源和模擬氮沉降處理對植物性狀的交互作用,統計分析用(SPSS Inc.,USA)及R完成。

2 結果與分析

2.1 氮添加對不同種源五角楓幼苗的比葉面積與干物質含量的影響

不同氮添加處理下,內蒙古種源五角楓幼苗(NW)和山西種源五角楓幼苗(SW)的LDMC表現出較為一致的響應趨勢,即氮添加條件下幼苗的LDMC均顯著低于對照,分別平均降低11.15%,13.99%,同時在超高氮(N4)的條件下幼苗的LDMC顯著高于低氮、中氮和高氮處理(P<0.01)。同時,NW幼苗的LDMC含量普遍比SW低。北京種源幼苗(BW)的LDMC在各氮添加處理下變化不顯著,在低、超高濃度氮添加下表現為增加,但差異不顯著(P>0.05)(圖2a,表1)。

圖2 氮添加處理下不同種源五角楓的葉片干物質含量(LDMC)及比葉面積(SLA)的變化規律Fig.2 Variations between LDMC and N0 and SLA and N0 of three provenance Acer mono seedlings under different nitrogen additionLDMC:葉片干物質含量, Leaf dry matter content;SLA:比葉面積,Specific leaf area;NW:內蒙古種源五角楓幼苗,Inner Mongolia provenances A. mono seedlings;BW:北京種源五角楓幼苗,Beijng provenances A. mono seedlings; SW:山西種源五角楓幼苗,Shanxi provenances A.mono seedlings

3個種源五角楓幼苗的比葉面積(SLA)與對照的差值在減小,說明對氮添加的響應總體上呈增加趨勢,NW,SW和BW分別增加4.16%、21.51%、4.67%。隨著氮添加濃度的增加,NW與BW的SLA表現為先降低后增加,并在N4條件下顯著增加,并達到最大(P<0.05)；SW的SLA的在氮添加條件下增加,在N2的水平下達到最大后降低,處理間差異顯著(P<0.05),SW的平均SLA大于其他兩個種源幼苗(圖2b,表1)。

2.2 氮添加對五角楓葉片N、P化學計量學特征的影響

不同種源的五角楓幼苗的葉片氮質量濃度Nmass、磷質量濃度Pmass、氮面積濃度Narea、磷面積濃度Parea以及N∶P,呈現不同的變化趨勢(表2)。氮添加處理下SW種源幼苗葉片的Pmass顯著增加,并在低氮(N1)水平最大(P<0.05),Nmass在N1和N3水平顯著高于對照(P<0.05)。N∶P在N1水平表現為降低,N2、N3水平表現為增加,但是變化均不顯著。NW和BW幼苗葉片的N、P化學計量學特征變化均不顯著,但是Nmass和Narea在中氮和中高氮水平下表現為增加趨勢,而Pmass和Parea在中氮和中高氮水平下表現為降低趨勢,同時N∶P在低氮水平表現為降低,高氮水平表現為增加,這與N、P濃度的變化趨勢相近。

表1氮添加處理對不同種源五角楓的葉片干物質含量和比葉面積影響的單因素方差分析及多重比較(均值±標準誤,n=9)

Table1SinglefactorvarianceanalysisandLSDoftheeffectofnitrogenadditionontheLDMCandSLAofthreeprovenanceAcermonoseedlings(mean ± SE,n=9)

功能性狀Functionaltraits處理Treatments內蒙古種源(NW)InnerMongoliaprovenancesA.monoseedlingsF北京種源(BW)BeijngprovenancesA.monoseedlingsF山西種源(SW)ShanxiprovenancesA.monoseedlingsF葉干物質含量N0502.33±16.26a9.62**468.86±15.610.22525.76±35.56a7.26**LeafdrymattercontentN1440.70±19.26b474.59±31.91441.05±4.28bLDMC/(g/kg)N2422.95±5.07b461.25±3.35434.00±15.67bN3422.02±9.92b464.12±9.03439.50±9.57bN4499.68±9.80a482.07±15.42494.24±8.42aN015.92±3.19ab2.50*15.13±0.061.3414.08±1.31a1.64*比葉面積N114.21±0.72b14.35±1.5516.22±1.35abSpecificleafareaN215.06±1.03b14.35±1.1018.32±1.13bSLA/(m2/kg)N316.05±1.78ab14.75±1.2716.20±0.94abN421.03±2.14a19.89±3.6717.69±1.18ab

同列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05);F檢驗值表示該組處理差異顯著，*:P<0.05;**:P<0.01

表2氮添加對不同種源五角楓的化學計量學指標的單因素方差分析及變異系數(均值±標準誤,n=9)

Table2SinglefactorvarianceanalysisandcoefficientofvariationoftheeffectofnitrogenadditiononthestoichiometriccharacteristicsofthreeprovenanceAcermonoseedlings(mean±SE,n=9)

性狀Traits處理TreatmentsNWCVFBWCVFSWCVFN010.82±1.614.790.09912.99±1.3010.000.6488.95±0.748.270.065Nmass/N111.57±1.2310.639.76±1.7517.9312.24±0.988.00(mg/g)N210.81±0.242.2212.47±2.2217.8010.45±0.958.61N311.34±4.1436.5111.88±0.766.4013.13±0.806.09N410.49±0.686.4811.81±0.645.4211.66±0.584.97N01.29±0.2116.280.631.26±0.086.350.551.21±0.23a19.013.76*Pmass/N11.91±0.084.191.60±0.3220.001.95±0.22b11.28(mg/g)N21.98±0.2211.11.50±0.053.331.38±0.09ac6.52N31.35±0.6648.891.44±0.064.171.57±0.09abc5.73N41.70±0.4224.711.35±0.096.671.41±0.07ac4.96N00.07±0.0045.710.770.09±0.0088.890.910.06±0.01a16.673.96*Narea/N10.08±0.00911.250.07±0.00710.000.07±0.008b11.43(mg/cm2)N20.07±0.0068.570.09±0.0222.220.05±0.005ab10.00N30.06±0.01626.670.08±0.0112.500.08±0.004b5.00N40.06±0.01220.000.06±0.00915.000.07±0.001a1.43N00.008±0.00045.000.820.008±0.00067.501.10.009±0.00222.221.71Parea/N10.014±0.0017.140.01±0.00110.000.01±0.00220.00(mg/cm2)N20.013±0.0017.690.01±0.00110.000.008±0.00056.25N30.007±0.00342.860.01±0.00110.000.01±0.00110.00N40.01±0.00440.000.008±0.00225.000.008±0.000810.00N08.40±0.141.672.6810.39±1.6816.172.237.54±0.8110.741.01N∶PN16.02±0.477.816.19±0.406.466.50±1.1117.08N25.61±0.7212.838.45±1.3115.507.57±0.212.77N39.08±1.3514.878.25±0.222.678.44±0.8610.19N46.86±0.913.128.88±1.0111.378.34±0.698.27

不同小寫字母表示不同處理間存在顯著差異(P<0.05)；Nmass:氮質量濃度,Nitrogen mass concentration; Pmass:磷質量濃度,Phosphorus mass concentration; Narea: 氮面積濃度,Nitrogen area concentration; Parea:磷面積濃度,Phosphorus area concentration; N∶P:氮磷比,N-P ratio; NW:內蒙古種源五角楓幼苗,Inner Mongolia provenancesA.monoseedlings; BW:北京種源五角楓幼苗,Beijng provenancesA.monoseedlings; SW:山西種源五角楓幼苗,Shanxi provenancesA.monoseedlings; CV:變異系數,Coefficient of Variance

2.3 五角楓葉片功能性狀變異來源的相關性分析

為探究五角楓幼苗LDMC與SLA性狀及氮磷化學計量學特征發生變異的來源,對實驗數據進行氮添加處理和種源的雙因素方差分析及相關性檢驗(表3)。結果表明：SLA、LDMC、Parea及N∶P與氮添加處理呈顯著的相關關系(P< 0.05),與種源無顯著的相關關系。同時五角楓幼苗的SLA、LDMC、Nmass、Pmass、Narea、Parea和N∶P對氮添加處理和種源的交互作用均未表現出相關關系。說明五角楓幼苗的這些性狀變化主要受氮添加處理影響。

表3 氮添加和種源對幼苗生長指標影響效應的雙方差分析Table 3 Variance analysis of the growth index effect in Processing and provenance of Acer mono seedling

*,P< 0.05; **,P< 0.01; LDMC:葉干物質含量,Leaf dry matter content; SLA比葉面積,Specific leaf area; Nmass:氮質量濃度,Nitrogen mass concentration; Pmass:磷質量濃度,Phosphorus mass concentration; Narea: 氮面積濃度,Nitrogen area concentration; Parea:磷面積濃度,Phosphorus area concentration; N∶P:氮磷比,N-P ratio

3 討論

葉片作為木本植物制造有機物的主要器官,與植物的有機物生產過程密切相關,并且在不同生境條件下和不同物種之間存在很大的差異性[32-33]。在本研究中,NW和SW葉片的LDMC含量在氮添加條件下比BW低,低中濃度的氮添加條件下表現為抑制作用,在N4條件下表現為顯著的促進作用。同時,BW的LDMC含量在N1、N2、N3條件下均高于同水平下的SW和NW。氮添加條件下,SW的SLA增加程度最大。有研究指出資源相對豐富的環境中植物的SLA更大, 植物個體對資源的利用、光合和生長能力更強,而在貧瘠的環境中SLA小的植物適應能力更強[34-35]。山西種源五角楓幼苗(SW)原生境的環境資源相對豐富,對高氮環境有更好的資源利用能力,更能適應氮沉降量相對較多的環境。該結論與SW原生境地區氮沉降背景相一致[28]。將SLA和LDMC綜合考慮,一般認為SLA減小的同時LDMC增加表示植物所處環境條件的惡化,此時植物傾向于適應保守的生長策略[36,34]。就資源獲取方面,Rose等認為具有低SLA和高LDMC的植物,其資源獲取能力以及水分的利用效率往往更高,更容易適應惡劣的環境條件[37]。土壤N濃度的改變,使山西種源五角楓幼苗資源利用方式發生變化,使其傾向保守的生長策略,即對環境變化較為靈活的生長策略。因此可以看出,在氮添加條件下,SW比BW和NW有更強的環境資源利用能力,并且其在生長過程中逐步采取較為保守的生長方式,相比而言NW在高氮沉降的環境中的資源利用能力最差。因此氮沉降改變了五角楓幼苗的適應策略。在植物根、莖、葉各生理活動的運作過程中,碳、氮、磷各元素之間達到相互平衡,尤其是植物葉片氮磷相互作用,能對外界環境的變化做出積極的響應,因此根據植物葉片氮磷含量判斷生境營養狀況是生態化學計量學的重要部分[38]。相比對照而言,氮添加條件下3個種源五角楓的Nmass、Narea、Pmass和Parea均表現為增加,這與眾多研究的結果一致,均認為適量的氮添加能夠增加植物葉片的TN、TP[7,39]。在不同濃度的氮添加下,只有SW的Pmass在N1水平下顯著增加,Nmass在N1和N3水平下表現為顯著增加。說明在低氮水平下, SW對P的吸收加強,從而增加植物體內對P的積累。同時在低氮和中高氮條件下, SW對氮的吸收加強,說明SW能較好的適應低氮和高氮環境,使其生存能力更強,能夠適應不同的環境條件。同時比較N、P變化情況可以發現,隨著氮添加濃度的升高,N、P值在中氮或者高氮水平達到最大值后開始下降,說明一定范圍之內外源氮輸入對于植物生長的起到促進作用,而超過了這個閾值,植物的生長就會出現抑制現象[40,9]。

植物葉片的N∶P從某種程度上能夠直觀的反映植物生長受N或P的限制情況。Güsewell認為N∶P<10和>20可作為植被水平氮、磷限制的評價指標[41]。通過表2中N∶P的變異系數可以看出,N∶P的變異系數小于N、P,也說明N∶P對植物體生長存在一定的關聯。早期通過多種施肥實驗總結得出,當植物葉片N∶P > 16表示植物生長主要受P限制,而葉片N∶P < 14時,主要受N限制, 當 N∶P位于14到16之間時,則植物生長受到二者的共同限制[42]。在本研究中,五角楓幼苗的N∶P<14,說明研究的五角楓幼苗的生長均受到N的限制,而對于不同種源的五角楓幼苗,在氮添加條件下受限制程度不同。可以看出,SW的N∶P在氮添加條件下增加,施氮有利于SW的N積累。同樣在石賢萌等對哀牢山兩種濕性常綠闊葉樹種幼苗的研究中得出[43],氮添加可以增加植物N含量。而NW和BW比對照有所降低,可能原因是由于氮添加促進其對P素的吸收。有氮添加控制實驗[44]發現,氮沉降有利于降低植物N∶P,而主要原因是由于植物體內P的增加,可能原因是多余的氮素能夠促進陸地生態系統中P的循環速率,從而促進植物對P的吸收[45]。而目前植物P含量對氮添加的響應存在不同的規律,李德軍等[40]及Macklon等[46]地研究說明,氮沉降使土壤有效N增加,引起土壤酸化,在增加植物體內氮的同時,抑制幼苗對P的吸收,使N∶P增加。在本研究中,氮添加促進實驗樣地中五角楓對P的吸收,使得不同種源五角楓葉P比葉N增加更多,可能是導致N∶P降低的原因。而對于本實驗來說,氮添加如何促進土壤P的循環以及尋找五角楓受N限制的其他原因,還需要進一步探究。

根據葉經濟譜理論,LDMC、SLA、葉N含量、葉P含量以及N∶P是考量植物對環境資源權衡策略的部分重要指標[47]。在一些研究中指出,有較低LDMC、較高SLA、葉N含量和葉P含量的樹種通常具有較高的光合速率和生長速率,具有這些功能性狀變化的植物往往屬于“快速投資-收益”型,反之則傾向于“緩慢投資-收益”型[48]。本研究中,在氮添加的條件下,NW的LDMC顯著降低,SLA顯著增大,同時葉N含量、葉P含量以及N∶P比較高；SW的LDMC顯著降低,但均值比NW大,SLA增大,同時葉N含量、葉P含量表現為顯著增大；BW的LDMC和SLA較其他兩個種源的五角楓也有所增加,但變化不顯著,同時葉N含量、葉P含量以及N∶P含量比較低。由此可見, SW和NW屬于“快速投資-收益”型,而BW傾向于“緩慢投資-收益”型。生存環境發生變化,植物會對自身資源進行調整,從而優化配置,使自身適應新的環境[49]。因此,在氮添加下,五角楓在適應周圍環境的過程中,不同種源的五角楓的適應策略發生了改變。從變異來源分析得出,各種源五角楓適應策略的改變主要來源于氮添加處理,也說明氮沉降確實改變了五角楓的適應性。而與種源沒有顯著的關系,可能原因是由于物種的不同,不同的物種在種源的適應性方面存在一定的差異。所以對于五角楓而言,種源不是五角楓發生適應性差異的主要原因。另外,本實驗選取的部分功能指標變化未顯示出與種源的顯著關系,其他的指標研究有待于在下一步進行的工作中進行。

綜上,不論是從SLA和LDMC的結果,還是N、P化學計量學指標的結果均說明,在氮添加條件下,不同種源的五角楓表現出較為顯著的差異,證明不同種源的五角楓對氮沉降具有差異性的適應策略。所以,五角楓資源的保護利用以及引種栽培,均要充分考慮五角楓的種源差異,才能做出更加合理的方案和決策。

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