氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法用于甲磺酸左氧氟沙星片中甲磺酸乙酯的含量測定

侯金鳳+李珉+齊麟

[摘要] 目的 建立衍生化氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測甲磺酸左氧氟沙星片中甲磺酸乙酯的含量。 方法 采用柱前NaI-H2O碘化衍生，甲磺酸乙酯和內(nèi)標(biāo)化合物甲磺酸正丁酯分別經(jīng)衍生化反應(yīng)后得到碘乙烷和碘丁烷，經(jīng)聚乙二醇為固定相的熔融石英毛細管柱（0.32 mm× 60 m，0.25 μm）分離，質(zhì)譜法SIM模式下檢測衍生化產(chǎn)物碘乙烷和碘丁烷，以碘乙烷和碘丁烷的峰面積比值計算甲磺酸乙酯的含量。 結(jié)果 方法在2.5～150 ng/mL范圍之間，具有良好的線性（r = 0.9999）；檢測限為0.5 ng/mL，回收率為100.5%（RSD = 1.2%），重復(fù)性RSD為0.6%（n = 6），方法耐用性好，1批原料和3批樣品中均未檢出甲磺酸乙酯。 結(jié)論 該方法靈敏、簡便、準(zhǔn)確、快速，能夠用于測定甲磺酸左氧氟沙星合成和制劑過程中有可能產(chǎn)生的甲磺酸乙酯基因毒性雜質(zhì)含量的測定。

[關(guān)鍵詞] 甲磺酸左氧氟沙星；甲磺酸乙酯；基因毒性雜質(zhì)；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法

[中圖分類號] R917 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）01（c）-0126-04

[Abstract] Objective To establish a derivative gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） method for analyzing the contents of ethyl methanesulfonate （EMS） in Levofloxacin Mesylate Tablets. Methods Pre-column NaI-H2O derivating method was used， and the derivatives ethyl iodide and iodine butane were obtained from EMS and n-butyl methanesulfonate （BMS） derivatization. The derivatives were separated on a DB-WAX （0.32 mm×60 m， 0.25 μm） fused-silica capillary column firstly， and then detected by mass spectrometry under single ion monitoring （SIM） mode. The content of EMS was calculated by the area ratio of ethyl iodide to iodine butane. Results The method showed good linearity （r > 0.9999） over the range of 2.5-150 ng/mL. The limit of detection was 0.5 ng/mL， the recovery was 100.5% （RSD = 1.2%） and the repeatability RSD was 0.6% （n = 6）. The method also showed good robustness. No ethyl methanesulfonate was detected in one batch of API and three batches of tablets. Conclusion The method is sensitive， simple， accurate and rapid， and it can be used for the determination of genotoxic impurity EMS， which may be generated in the synthesis and preparation of Levofloxacin Mesylate.

[Key words] Levofloxacin Mesylate； Ethyl Methanesulfonate； Genotoxic impurity； Gas chromatography-mass spectrometry

甲磺酸左氧氟沙星是左氧氟沙星甲磺酸鹽的一水合物，抗菌活性是氧氟沙星的2倍，毒性低[1]。左氧氟沙星最早由日本第一制藥研制開發(fā)，1996年，北京雙鶴藥業(yè)研制開發(fā)了甲磺酸左氧氟沙星，并于1998年在國內(nèi)上市，商品名為利復(fù)星[2-3]。甲磺酸左氧氟沙星在合成和制劑過程中用到甲磺酸和乙醇，可能導(dǎo)致甲磺酸乙酯（EMS）的生成[4]。而甲磺酸酯類作為遺傳毒性雜質(zhì)[5]，研究表明可能會誘發(fā)基因突變和染色體畸變，并且對大鼠和小鼠有致癌作用[6-7]。歐洲藥品局（EMEA）和美國FDA相繼出臺了基因毒性雜質(zhì)限度的指導(dǎo)原則，對基因毒性雜質(zhì)做出限度規(guī)定[8-10]。目前，已報道的EMS測定方法有氣相色譜法（GC）[11-13]、液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）[14-16]和氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）[17-19]。由于GC法本身的缺陷，使得該法的靈敏度較低，而LC-MS法操作較為繁瑣。本文參考歐洲藥典8.0版《甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯在原料藥中的測定》[20]，建立簡便、快速的衍生化GC-MS法，測定甲磺酸左氧氟沙星原料和片劑中可能存在的EMS。

1 儀器與試藥

Thermo Scientific氣質(zhì)聯(lián)用儀，Thermo公司產(chǎn)品，配有Trace GC ULTRA氣相色譜系統(tǒng)，包括TriPlus AS頂空進樣器、柱溫箱、TSQ Quantum三重四極桿質(zhì)譜及Xcalibur數(shù)據(jù)處理軟件。

甲磺酸乙酯對照品（EMS，批號：10315，純度99.5%，Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司）；甲磺酸正丁酯對照品（批號：0143739-130930000，純度95%，F(xiàn)luorochem有限公司）；甲磺酸左氧氟沙星原料（批號：AA130337，北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司）；甲磺酸左氧氟沙星片（批號：120732、120733、120734，北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司）；碘化鈉（批號：F20110504，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；硫代硫酸鈉（批號：F20081008，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（HPLC級，Merck公司）；甲苯（批號：20121008，分析純，北京現(xiàn)代東方精細化學(xué)品有限公司）；水（去離子水，Milli Q制備）。endprint

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

氣相色譜，色譜柱：聚乙二醇為固定相的熔融石英毛細管柱（DB-WAX，0.32 mm× 60 m，0.25 μm）；柱溫：40℃，保持1 min；5℃/min升溫至130℃；30℃/min升溫至210℃，保持7 min；載氣：高純氦氣，流速：0.8 mL/min，恒流模式；進樣針溫度：110℃；進樣口溫度：130℃；分流流量：10 mL/min；平衡溫度：60℃；平衡時間：30 min；頂空進樣。

質(zhì)譜，傳輸線溫度：210℃；離子源溫度：250℃；電離源：EI源；能量：70 eV；分析器：四極桿質(zhì)量分析器；監(jiān)測模式：SIM模式下監(jiān)測m/z156、m/z184和m/z127，其中m/z156和m/z184分別為碘乙烷（甲磺酸乙酯衍生化產(chǎn)物）和碘丁烷（內(nèi)標(biāo)物甲磺酸正丁酯衍生化產(chǎn)物）的定量離子，m/z127為碘乙烷和碘丁烷的定性離子。

2.2溶液配制

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液配制 取甲磺酸正丁酯對照品溶液10 μL，置于10 mL量瓶中，加混合溶劑[水-乙腈（20∶80）]使溶解并稀釋至刻度，搖勻。取該溶液20 μL，置于100 mL量瓶中，加混合溶劑稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 衍生化試液配制 稱取無水硫代硫酸鈉30 mg和碘化鈉60.0 g，置于50 mL量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制 稱取甲磺酸乙酯對照品約25 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲苯溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取該溶液1 mL，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋制成濃度為5 μg/mL的對照品儲備溶液。分別精密量取對照品儲備溶液適量，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋制成5、10、25、50、100、150、200、250、300 ng/mL的系列濃度甲磺酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.2.4 供試品溶液配制 取甲磺酸左氧氟沙星片20片，精密稱定，研細，精密稱取適量（約相當(dāng)于左氧氟沙星25 mg，原料直接稱取相當(dāng)于左氧氟沙星25 mg），置20 mL頂空瓶中，分別精密加入內(nèi)標(biāo)溶液0.5 mL和衍生化試液0.5 mL，密封，作為供試品溶液。

2.4 方法驗證

2.4.1 專屬性 稱取甲磺酸左氧氟沙星片空白輔料適量（約相當(dāng)于左氧氟沙星25 mg），置20 mL頂空瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液0.5 mL和衍生化試液0.5 mL，密封。結(jié)果表明，在碘乙烷出峰處，無干擾，方法專屬性良好。見圖1。

2.4.2 線性 分別取系列濃度的甲磺酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.5 mL，置20 mL頂空瓶中，加衍生化試液0.5 mL，密封。以溶液濃度為橫坐標(biāo)，碘乙烷和內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，線性回歸方程為：Y = 0.002 764+0.016 08X（r = 0.9999）。結(jié)果表明：甲磺酸乙酯濃度在2.5～150 ng/mL之間，線性關(guān)系良好。

2.4.3 檢測限與定量限 用內(nèi)標(biāo)溶液分別配制濃度為5、1、0.5、0.25 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密量取0.5 mL，置20 mL頂空瓶中，加衍生化試液0.5 mL，密封。碘乙烷色譜峰信噪比約為10時的濃度為定量限，信噪比約為3時的濃度為檢測限。結(jié)果表明，定量限為2.5 ng/mL（圖1），檢測限為0.5 ng/mL（圖2）。

2.4.4 回收率 取甲磺酸左氧氟沙星片20片，研細，稱取適量（約含左氧氟沙星25 mg），置20 mL頂空瓶中，分別精密加入低、中、高三個濃度的對照品溶液（10、50、150 ng/mL）0.5 mL和衍生化試液0.5 mL，密封，每濃度平行3份。另稱取本品細粉適量（約含左氧氟沙星25 mg），制備未加標(biāo)供試品溶液。結(jié)果表明，低、中、高三個濃度的甲磺酸乙酯平均回收率為100.5%，RSD為1.2%。見表1。

2.4.5 精密度 精密量取濃度為100 ng/mL甲磺酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.5 mL，置20 mL頂空瓶中，加衍生化試液0.5 mL，密封，平行6份。碘乙烷與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD為0.6%，滿足分析要求。

2.4.6 溶液穩(wěn)定性 新制濃度為100 ng/mL甲磺酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別于配制后0、2、4、6、8、24 h精密量取0.5 mL，置20 mL頂空瓶中，加衍生化試液0.5 mL，密封。結(jié)果表明，甲磺酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液在室溫條件下放置24 h穩(wěn)定。見表2。

2.4.7 色譜系統(tǒng)的耐用性 精密量取濃度為100 ng/mL甲磺酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.5 mL，置20 mL頂空瓶中，加衍生化試液0.5 mL，密封。在其他條件不變的情況下，將40～130℃的升溫速率分別設(shè)為每分鐘4、5、6℃，各平行2份樣品。結(jié)果表明，RSD<10%，方法耐用性良好。見表3。

2.5 供試品溶液測定

取供試品溶液分別測定。計算碘乙烷與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程中，計算測定的濃度。按（1）式和（2）式分別計算甲磺酸左氧氟沙星片和原料中甲磺酸乙酯的含量：

片劑中甲磺酸乙酯含量（%）=（C×W×10-9×100）/（W×L×10-3）（1）；

原料中甲磺酸乙酯含量（%）=（C×10-9×100）/（W×0.76×10-3）（2）。

式中，C為樣品測定濃度（ng/mL），W為平均片重（g），W為樣品稱樣量（mg），L為標(biāo)示量（g/片），0.76為左氧氟沙星與甲磺酸左氧氟沙星的折算系數(shù)。

測定了1批次原料和3批次的甲磺酸左氧氟沙星片，均未檢出。

3 討論

甲磺酸烷基酯類雜質(zhì)具有遺傳毒性，屬于EMEA中明確要求藥品中應(yīng)嚴(yán)格控制的雜質(zhì)，毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）日最大攝入量為1.5 μg/d[21]。根據(jù)甲磺酸左氧氟沙星最大日服用量為750 mg，計算甲磺酸酯類雜質(zhì)總量的限度為0.0002%。本文所建立方法靈敏度高，檢測限和定量限分別為0.5 ng/mL和2.5 ng/mL，按照供試品濃度25 mg/mL計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別為0.000 002%和0.000 01%，遠低于限度值。此外，該方法線性范圍寬，準(zhǔn)確性好，簡便、快速，成功地實現(xiàn)了甲磺酸左氧氟沙星合成和制劑過程中有可能產(chǎn)生的甲磺酸乙酯基因毒性雜質(zhì)的有效控制，為藥物的安全性保障提供了很好的技術(shù)支撐。endprint

[參考文獻]

[1] 李曉冰，何曉靜，徐輝，等.左氧氟沙星在肺炎克雷伯菌肺部感染小鼠體內(nèi)的藥動學(xué)[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2017， 37（7）：575-578.

[2] 國家藥典委員會.臨床用藥須知[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：563-565.

[3] 郭成，何偉.甲磺酸左氧氟沙星的合成及結(jié)構(gòu)確證[J].安徽醫(yī)藥，2010，14（4）：401-403.

[4] Snodin DJ. Residues of genetic alkyl mesylates in mesylate salt drug substance：real or imaginary problems？ [J]. Regul Toxicol Pharm，2006，45（1）：79-90.

[5] Szekely G，Amores de Sousa MC，Gil M，et al. Genotoxic impurities in pharmaceutical manufacturing：source，regulation，and mitigation [J]. Chem Rev，2015，115（16）：8182-8229.

[6] Dobo KL，Greene N，Cyr MO，et al. The application of structure- based assessment to support safety and chemistry diligence to manage genotoxic impurities in active pharmaceutical ingredients during drug development [J]. Reg Toxicol Pharm，2006，44（3）：282-293.

[7] Benigni R，Bossa C. Mechanisms of chemical carcinogenicity and mutagenicity：a review with implications for predictive toxicology [J]. Chem Rev，2011，111（4）：2507-2536.

[8] Guidelines on the Limits of Genotoxic Impurities [EB/OL]. EMEA，2006. [2006-6-28]. http：//www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500002903.pdf.

[9] Nancy Bower. A review of the new draft FDA guidance on genotoxic and carcinogenic impurities [J]. Regulatory Rapporteur，2009，6（4）：13-15.

[10] Kroes R，Kleiner，Renwick A. The threshold of toxicological concern concept in risk Assessment [J]. Toxicol Sci，2005，86（2）：226-230.

[11] 邱妍川，李躍芬，鐘玲，等.毛細管氣相色譜法測定阿侖膦酸鈉原料藥中甲烷磺酸乙酯的殘留量[J].中國藥房，2014，25（24）：2295-2297.

[12] 范達，涂家生.頂空氣相色譜法測定注射用甲磺酸吉米沙星中基因毒性雜質(zhì)[J].藥學(xué)進展，2014，38（3）：220-223.

[13] 連小剛，李孝壁，程紅艷.衍生氣相色譜法測定甲磺酸伊馬替尼中甲磺酸烷基酯類[J].中國醫(yī)藥科學(xué)，2013，3（17）：128-130.

[14] 劉俊華，鐘雅妮，熊淵，等.LC-MS測定甲磺酸伊馬替尼中基因毒性雜質(zhì)的含量[J].藥物分析雜志，2013，33（7）：1168-1170.

[15] Kakadiya PR，Chandrashekhar TG，Ganguly S，et al. Low Level Determinations of Methyl Methanesulfonate and Ethyl Methanesulfonate Impurities in Emtricitabine Active Pharmaceutical Ingredient by LC/MS/MS Using Electrospray Ionization [J]. Anal Chem Insights，2011，6：21-28.

[16] 陳成，尹璐，王媛，等.LC-MS/MS法測定2-脫氧-D-核糖中的甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的含量[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2015，32（9）：695-698.

[17] 劉立云，張倩如，孫連福，等.GC-MS法同時測定鹽酸決奈達隆中的3種甲磺酸酯[J].中國藥師，2014，17（8）：1274-1276.

[18] 毛頤晴，李緯，朱麗君.GC-MS法測定甲磺酸萘莫司他原料藥中的遺傳毒性雜質(zhì)[J].中國藥房，2016，27（18）：2555-2557.

[19] 易大為，鄒宇，趙曉東，等.GC-MS法測定甲磺酸培氟沙星中甲磺酸酯雜質(zhì)的研究[J].中國抗生素雜志，2017， 42（6）：521-525.

[20] Council of Europe. European Pharmacopoeia 8.0 [S]. Strasbourg：Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare of the Council of Europe（EDQM），2013：170-171.

[21] European Medicines Agency. Evaluation of medicines for human use，guideline on the limits of genotoxic impurities [EB/OL]. [2014-01-27]. http：//www.rsihata.com/updateguidance/emea /old/519902en.pdf.

（收稿日期：2017-08-30 本文編輯：張瑜杰）endprint