肺泡灌洗液GM試驗對肺部侵襲性曲霉菌感染的診斷價值

單宇+劉軍權+祝宇翀

[摘要] 目的 分析支氣管肺泡灌洗液（BALF）半乳甘露聚糖（GM）試驗結果與侵襲性肺曲霉菌培養陽性結果間的相關性。 方法 收集2014年1月～2016年12月浙江省650家醫療合作點（包括三級、二級和社區醫院）8086例患有呼吸系統疾病住院患者的BALF，同時采集1459例患者血清；采用GM試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書對BALF和血清樣本進行GM試驗，通過觀察GM試驗的I值結果分析對侵襲性肺曲霉菌?。↖PA）的診斷價值及BALF結果分析IPA診斷符合率。用沙保弱培養基按常規方法進行真菌培養。曲霉菌鑒定：培養陽性的真菌經KOH制片，在顯微鏡下觀察形態和顏色區分曲霉菌。 結果 8086例BALF曲霉菌培養陽性樣本數為1193例。在曲霉菌陽性BALF樣本中，GM試驗I值<0.5為61例（5.11%）、0.5～<1.0為98例（8.21%）、1.0～<2.1為114例（9.56%）和≥2.1的為920例（77.12%），而無真菌生長組共5103例，I值<0.5為3623例（70.99%）、0.5～<1.0為827例（16.21%）、1.0～<2.1為376例（7.37%）和≥2.1為277例（5.43%），兩組各I值比較差異均有高度統計學意義（P < 0.01）；曲霉菌陽性組與念珠菌陽性組平均I值比較差異有高度統計學意義（P < 0.01）。BALF GM試驗I值與IPA診斷符合率分析：當I值設定為≥2.1，對IPA診斷的敏感性、特異性、陽性預測值及陰性預測值分別為77.12%、94.07%、76.86%及76.85%，與I值設定≥0.5為陽性的診斷效能（分別為94.89%、9.00%、43.34%及43.34%）比較差異有高度統計學意義（P < 0.01）。血清GM試驗結果顯示，曲霉菌陽性組I值≥0.5占30.63%，而無真菌生長組僅為6.55%，兩者比較差異有高度統計學意義（P < 0.01）。 結論 將GM試驗BALF的I值設定為≥2.1為陽性結果，對IPA更具診斷價值，而血清GM試驗I值設定為≥0.5較合適。

[關鍵詞] 曲霉菌；肺泡灌洗液；半乳甘露聚糖；真菌鑒定

[中圖分類號] R519 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）01（a）-0118-05

[Abstract] Objective To analyze the correlation between the results of galacto-mannan （GM） test in bronchoalveolar fluid （BALF） and the positive results of invasive pulmonary aspergillus. Methods From January 2014 to December 2016， 8086 BALF and 1459 serum from patients with respiratory disease in 650 cooperative medical institutions （including tertiary， secondary and community hospitals） in Zhejiang Province were collected. By using the GM test kits to carry out GM experiments in BALF and serum samples according to the instructions of the kit， the diagnostic value of the invasive pulmonary aspergillosis （IPA） was analyzed by the results of the I value， the IPA diagnosis compliance rate was analyzed with BALF results. Fungal culture was carried out in a conventional manner by using sand-fortified medium. Aspergillus identification： the fungal from the positive samples were cultured， so they could be subjected to 10% KOH based smear before microscopic observation， and then the Aspergillus were differentiated by their morphology and color. Results There were 1193 Aspergillus positive specimens among these 8086 BALF samples. In the Aspergillus positive samples， according to the results of I value of GM test： <0.5 for 61 cases （5.11%）， 0.5 to 1 for 98 （8.21%）， 1.1-2.0 for 164 （9.56%） and >2.1 for 870 （77.12%）； and in 5103 cases which had no fungal growth， the results of I value of GM test was： <0.5 for 3623 cases （70.99%）， 0.5-1 for 827 cases （16.21%）， 1.1-2.0 for 376 cases （7.37%） and >2.1 for 277 cases. There was a significant difference between these two groups （P < 0.01）. There also was a significant difference between the Aspergillus positive group and the Candida positive group （P < 0.01）. The analysis of I value of GM test in BALF and invasive pulmonary aspergillosis （IPA） diagnostic coincidence rate： When the I value was set to ≥2.1， the sensitivity， specificity， positive predictive value and negative predictive value of IPA diagnosis were as follows： 77.12% 94.57%， 76.86% and 76.85%， the differences were statistically significant （P < 0.01）； with the analysis thatwhen I value was set to be≥0.5 for positive results （94.89%， 9.00%， 43.34% and 43.34%， respectively）. The results of GM test in serum showed that the I value of the Aspergillus positive group was 0.5.63%， and the growth without fungal was only 6.54%， the differences were statistically significant （P < 0.01）. Conclusion When the I value is set to ≥2.1， the result of the GM test in BALF is significantly more valuable. When the I value isset to ≥0.5， the I value of GM test in serumis more appropriate.endprint

[Key words] Aspergillus； Bronchoalveolar lavage fluid； Galactomannan； Fungal identification

曲霉菌是侵襲性肺真菌感染（invasive fungal infections，IFI）最為常見的病原菌之一[1-2]，曲霉菌感染引起的侵襲性肺曲霉菌?。╥nvasive pulmonary aspergillosis，IPA）也是肺侵襲性真菌?。╥nvasive fungal disease，IFD）的主要種類。支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）測定是曲霉菌感染檢測的重要實驗室指標。許多實驗研究發現[3-4]，應用BALF進行GM試驗能為IFI的診療提供有價值的臨床診斷依據。由于GM試驗試劑盒應用說明大多局限于血清樣本，在《全國臨床檢驗操作規程》第4版中將支氣管肺泡灌洗液等體液標本檢測的GM試驗I值≥0.5判斷為陽性。由于BALF和其他血清標本來源和性質的不同，結果判斷存在很大差異。為此，我們對8086例BALF的GM試驗結果進行回顧性總結，提出BALF的GM試驗陽性結果判斷范圍。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年1月～2016年12月送杭州金域醫學檢驗所檢測的8086例患有呼吸系統疾病、具有完整臨床資料、臨床疑診真菌感染患者的BALF，其中男5394例，女2692例；年齡61～86歲，中位年齡72歲。在收集BALF同時，采集患者血清（實際僅采集到1459例）。BALF和血清樣本來源于浙江省650家醫療合作點（包括三級、二級和社區醫院）的住院患者，樣本由當地醫院醫師或護士采集。采樣完成后由杭州金域物流人員上門收取，放置于標本運輸箱中，4℃冷鏈運輸。經物流當日送達杭州金域醫學檢驗所，統一由金域檢驗技術人員在樣本采集后48 h內對樣本進行GM試驗和BALF真菌培養。

1.2 儀器和試劑

沙保培養基（廣州迪景微生物科技有限公司）；曲霉菌抗原檢測試劑盒（酶聯免疫法，96人份/盒，美國BIO-RAD公司產品）；Sunrise酶標儀（奧地利Tecan公司）；Bio-rad洗板機（美國伯樂）；JW-3022HR高速冷凍離心機（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；ZW-A微量振蕩儀（常州高德儀器制造有限公司產品）；生化培養箱（廣東省醫療器械廠）；SSW-600-2S型電熱恒溫水槽（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）。

1.3 IPA判定

侵襲性肺部曲霉菌感染診斷標準參照歐洲癌癥研究治療組織和真菌病研究組（EOR-TC/MSG）制定的診斷標準[5]和我國制定的《肺真菌病診斷和治療專家共識》[6]及《侵襲性肺部真菌感染的診斷標準與治療原則》[7]等有關標準，需同時符合宿主因素、臨床標準和微生物學標準3個方面。本研究根據已檢樣本結果和患者住院期間病歷、患者臨床癥狀體征、影像及微生物學檢測結果為IPA診斷依據。

1.4 樣本采集方法

1.4.1 BALF采集 BALF采集按氣管鏡操作SOP進行，選用2%利多卡因進行麻醉，局麻后經鼻行支氣管鏡檢測，依HRCT定位將支氣管鏡插入至目標亞段支氣管，注入37℃滅菌生理鹽水30～60 mL，進行病變部位的支氣管肺泡灌洗，回收15～30 mL BALF，將回收液裝入硅塑瓶中，4℃保存。

1.4.2 血清標本 行支氣管鏡采集BALF當日早晨使用真空采血管采集非抗凝血3 mL，4000 r/min離心10 min，4℃冰箱保存等待檢測。

1.5 GM 試驗

1.5.1 BALF標本的檢測 將待測BALF轉移入1.5 mL離心管，10 000 r/min 離心10 min，取離心后BALF上清液300 μL加入100 μL處理液混勻，100 ℃水浴3 min。10 000 r/min離心10 min，取上清備用。ELISA 檢測孔每孔加入50 μL結合液、50 μL處理后上清液，37℃孵育90 min。清洗后，每孔加入375 μL清洗液，吸干；每孔加入顯色液200 μL，室溫避光孵育30 min后，每孔加入終止液100 μL。在波長450 nm酶標儀下讀板，根據OD值換算檢測BALF中GM含量。每次實驗均設陰性對照、陽性對照、臨界值對照，以驗證實驗結果的有效性。結果計算：樣本指數（I值）=樣本OD值/2個臨界樣本平均OD值。

1.5.2 血清標本的檢測 試驗嚴格按照GM試劑盒說明書操作，具體步驟如下：取待測血清300 μL加入100 μL處理液混勻，100℃水浴3 min。10 000 r/min離心10 min，取上清備用。ELISA 檢測孔每孔加入50 μL結合液、50 μL處理后上清液，37℃孵育90 min。清洗后，每孔加入375 μL清洗液，吸干；每孔加入顯色液200 μL，室溫避光孵育30 min后每孔加入終止液100 μL；在波長450 nm酶標儀下讀板，根據OD值換算檢測血清中GM含量。結果換算方法同BALF樣本。

1.6 真菌培養

用紅外線加熱器滅菌接種針/環，用接種環沾取BALF 10 μL，接種于沙保弱培養基中，放置恒溫（27±1）℃培養。某些雙相真菌需要同時放置37℃培養，分別于24 h、48 h和72 h觀察，如果有真菌生長使用梅里埃生化鑒定板和顯微鏡法直接鑒定。如果無真菌生長繼續培養至5～7 d，對于高度懷疑真菌感染患者標本，或懷疑某些生長較慢真菌時培養時間應延長至2～4周，每周觀察，4周后無真菌生長報陰性。

1.7 曲霉菌屬直接鑒定

按《全國臨床檢驗操作規程》第4版“真菌常規制片鑒定”要求，將培養陽性的真菌用KOH制片，直接在顯微鏡下觀察，通常曲霉菌為菌體45°角分支，直徑在3～6 μm。曲霉菌屬鑒定按形態學特征、菌落形態和分生孢子顏色進行群的劃分，然后以分生孢子的形態、顏色、產孢結構的數目、頂囊的形態及有性孢子的形態進行菌種鑒定。endprint

1.8 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，按照廠家推薦標準，BALF和血清GM試驗以待測標本的指數（I）≥0.5為診斷界值。采用四格表χ2檢驗分析GM試驗的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值的差異，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BALF GM試驗I值與真菌培養結果比較

8086例BALF曲霉菌培養陽性樣本數為1193例。在曲霉菌陽性BALF樣本中，I值≥2.1為920例（77.12%），而無真菌生長組≥2.1為277例（5.43%），兩者結果比較差異均有統計學意義（P < 0.01）；曲霉菌陽性組與念珠菌陽性組平均I值組間結果比較差異有高度統計學意義（P < 0.01）。曲霉菌陽性組I值大多≥2.1（占77.12%），而無真菌生長組為（5.43%），說明BALF的GM試驗曲霉菌真陽性結果的敏感I值為2.1以上。見表1。

2.2 BALF GM試驗I值與IPA診斷符合率分析

為觀察GM檢測對IPA診斷的靈敏度，將GM試驗比色后換算的I值分別進行分組（≥0.5、≥1.1、≥2.1）比對。結果提示：當I值設定為≥2.1，對IPA診斷的敏感性、特異性、陽性預測值及陰性預測值與I值設定≥0.5者比較，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。見表2。

2.3 血清GM試驗I值與真菌培養結果比較

與BALF同時送檢的血清樣本（同一患者同時采樣）有1459例，血清經真菌培養陽性的樣本有680例，其中曲霉菌陽性組為333例，其中I值<0.5為231例（69.37%）、0.5～<1.0為29例（8.71%）、1.0～<2.1為31例（9.31%）和≥2.1為42例（12.61%），與念珠菌陽性組及無真菌生長組相同I值比較，差異均有統計學意義（P < 0.01），以無真菌生長組差異最明顯。I值為1.0～<2.1、≥2.1時，念珠菌陽性組與無真菌生長組比較，差異均有統計學意義（P < 0.01）。曲霉菌陽性組GM試驗的I值0.5及以上者占30.63%，而無真菌生長組僅為6.55%，提示血清GM試驗曲霉菌的真陽性結果的敏感值為0.5及以上。見表3。

3 討論

IFD是宿主免疫功能低下或缺陷時真菌侵入人體，在器官、組織或血液中生長，并導致機體炎癥反應和組織損傷等所致[8-10]。IFI指真菌感染氣管、支氣管和肺部組織，引起黏膜和肺部炎癥，造成急慢性肺組織損害的疾病，臨床IFI感染常見于白色念珠菌、曲霉菌屬等。IPA常見于老年患者，本研究統計分析的BALF標本均來自60歲以上的老年人。老年人免疫力低下，是肺部IFI的高發人群，且臨床表現缺乏特異性，常導致患者漏診、誤診、診斷不及時從而延誤疾病的治療而增加死亡率[11-13]。侵襲性曲霉菌菌感染的治療依賴早期的診斷和用藥，但臨床上診斷系統性曲霉感染經常遇到困難，病情缺乏特異的臨床表現，很多患者死亡后經尸檢才能發現存在曲霉菌感染。

β半乳甘露聚糖廣泛分布于曲霉菌細胞壁中，是除隱球酵母和接合菌屬外為曲霉菌特有的細胞成分，曲霉菌生長時半乳甘露聚糖從薄弱的菌絲頂端釋放，當這些成分進入人體血液或深部組織、被吞噬細胞吞噬消化后，半乳甘露聚糖從細胞壁中釋出。因此，對GM測定是曲霉菌感染的敏感指標[14-15]。GM試驗常用的標本有血清和BALF。BALF是通過纖維支氣管鏡向支氣管肺泡內注入生理鹽水，隨即抽吸獲取肺泡表面襯液，對其中的細胞成分和可溶性成分進行分析，該項技術已成為診斷肺部疾病的重要檢查手段。GM值作為檢測曲霉菌細胞壁半乳甘露聚糖陰陽性的早期檢測標準，在檢測率、檢測時間等方面的應用價值和應用效果均高于影像檢查方法和生物學檢查結果。目前國內尚無統一的BALF樣本GM試驗的cut-off值，且按全國臨床檢驗操作規程（第四版）確定BALF樣本GM樣本指數≥0.5為陽性結果時在臨床診斷中存在特異性不高的缺點[16]。本研究結果發現，BALF 的GM試驗陽性率顯著高于血清，其樣本指數（I）值也明顯高于血清結果，在I值≤2.1時準確性差。為此本研究回顧性總結8086例BALF的GM試驗結果，并與真菌培養及臨床診斷進行對比和綜合分析，為GM試驗樣本指數I值設定一則比較切合實際的域值。

本研究8086例BALF樣本中真菌培養曲霉菌陽性有1193例，其中GM陽性（設定指數I值≥2.1）有920例，占曲霉菌陽性占總檢測數的77.12%，相同域值的念珠菌陽性組和無真菌生長組分別為16.26%和5.43%； BALF GM的 I值在0.5～<2.1的樣本中曲霉菌培養陽性組只占總樣本數的17.77%，而念珠菌陽性組和無真菌生長組為31.45%和23.58%。這些數據提示，當BALF GM試驗的I值設定為≥2.1時，其對IPD診斷的特異性、真實性顯著增高；設定的I值在<2.1時曲霉菌陽性組的GM試驗結果陽性率反而顯著低于其他組，說明該值對IPD的診斷特異性、靈敏性和真實性較低。因而，筆者建議將BALF GM試驗陽性值設定為≥2.1，0.5～<2.1設定為可疑。在本研究統計的BALF樣本中，有部分真菌培養陰性但GM試驗I值明顯升高而出現假陽性，可能原因是BALF樣本與外界空氣環境為開放性，使一些青霉菌、曲霉菌污染樣本，或某些外抗原與GM試驗有交叉反應導致 GM 實驗呈現假陽性。

綜上所述，如果將BALF的GM試驗結果I值設定≥2.1時能提高IPA診斷的特異性（94.07%），但敏感性有所下降（77.12%），如果對某些I值較低但臨床癥狀較典型患者增加曲霉菌靶向線粒體和核糖體靶標的PCR檢測[17-18]將能彌補單一試驗的缺陷，提高IPA診斷的敏感性。有報道[19]認為，增加曲霉菌PCR的檢測內容，可以使IPD診斷結果靈敏度達到99%、特異性增加至98%，這些方法的聯合使用可為IPD的診斷提供更有價值的實驗室數據。endprint