空心蓮子草總黃酮對HepG2.2.15細胞HBsAg和HBeAg表達的影響

武謙虎+徐衛東+李偉東

[摘要] 目的 研究空心蓮子草總黃酮對乙肝病毒的體外抑制作用。 方法 將HepG2.2.15細胞接種于細胞培養板，然后隨機分為陰性對照組、實驗組和陽性對照組。陰性對照組用100 mL/L DMSO處理；各實驗組分別加入800、400、200、100 mg/L的空心蓮子草總黃酮，陽性對照組用800、400、200、100 mg/L的拉米夫定共培養；應用細胞培養技術和光密度測定法研究空心蓮子草總黃酮對HepG2.2.15細胞系HBsAg與HBeAg表達的影響。 結果 各實驗組對HepG2.2.15細胞中HBsAg的抑制率均有明顯的升高，實驗組與陰性對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.01），實驗組與陽性對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.05），實驗組中HBsAg的抑制率跟藥物劑量呈正相關；實驗組各劑量對HepG2.2.15細胞中HBeAg的抑制率均有明顯的升高，實驗組與陰性對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.01），實驗組與陽性對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.05），實驗組中HBeAg抑制率跟藥物劑量呈正相關。 結論 空心蓮子草總黃酮對HepG2.2.15細胞中HBsAg和HBeAg表達均有明顯的抑制作用。體外細胞培養證實空心蓮子草總黃酮有較強的抗乙肝病毒作用。

[關鍵詞] 空心蓮子草；總黃酮；HepG2.2.15細胞；HBsAg；HBeAg

[中圖分類號] R969 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）01（a）-0034-04

[Abstract] Objective To study the anti-HBV action of total flavonoids extracted from Alternanthera philoxeroides in vitro. Methods HepG2.2.15 cells were inoculated into the cell culture plates and then randomly divided into negative control group， experimental group and positive control group. The negative control group was treated with 100 mL/L DMSO， the experimental groups were treated with 800， 400， 200 and 100 mg/L total flavonoids extracted from Alternanthera philoxeroides. In the positive control groups， lamivudine was added at the concentration of 800， 400， 200 and 100 mg/L. Cell culture and optical density assay were used to study the effects of total flavonoids from Alternanthera philoxeroides on the expression of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cell line. Results The inhibit the expression of HBsAg in HepG2.2.15 cells in each experimental group was obviously higher， compared with the negative group， the difference was statistically significant （P < 0.01） and compared with the positive control group， the difference was statistically significant （P < 0.05）， the inhibition rate of HBsAg in the experimental group was positively correlated with the dose of the drug. Each dose of the experimental groups had obvious inhibitory effects on the expressions of HBeAg in HepG2.2.15 cells， compared with the negative control group， the difference was statistically significant （P < 0.01） compared with and positive control group， the difference was statistically significant （P < 0.05）， the inhibition rate of HBeAg in the experimental group was positively correlated with the dose of the drug. Conclusion Total flavonoids extracted from Alternanthera philoxeroides has obvious inhibitory effects on the expressions of HBsAg and HBeAg in HepG2. 2. 15 cells. Total flavonoids extracted from Alternanthera philoxeroides has strong anti-HBV action in vitro.endprint

[Key words] Alternanthera philoxeroides； Total flavon?oids； HepG2. 2. 15 Cells； HBsAg； HBeAg

空心蓮子草為莧科植物空心蓮子草Alternanthera philoxeroides（Mart.）Griseb.的干燥全草，又名空心莧，水花生。原產巴西，后隨植物種子帶入我國成為農業有害雜草。我國自20世紀70年代起，開始空心蓮子草防治感染性疾病的臨床應用研究。據《中藥大辭典》記載，本品性寒、味苦；具有清熱、涼血、解毒的功效。現代臨床用于治療麻疹、乙型腦炎、流行性出血熱、急性肝炎等病毒性疾病。本課題組前期研究發現空心蓮子草對四氯化碳、半乳糖胺、乙醇所致的化學性肝損傷和卡介苗+脂多糖所致的免疫性肝損傷均具有一定的保護作用[1-3]；臨床觀察也表明空心蓮子草能有效改善慢性乙肝患者的肝臟功能和臨床癥狀[4]；尚有文獻報道其提取物體外具有抗多種病毒[5]和增強機體免疫功能[6]等作用。為探討空心蓮子草對乙肝病毒體外抑制作用，為空心蓮子草用于治療乙型肝炎提供理論依據，本研究提取分離了空心蓮子草的總黃酮部位，且用該提取物做了HepG2.2.15細胞培養試驗，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 藥物、主要試劑和儀器

HBeAg、HBsAg試劑盒（上海科華公司，批號：2016120066），胎牛血清（上海雙洳生物科技有限公司，批號：20161212），DMEM、G418、谷氨酰胺均為分析純試劑。二氧化碳培養箱（美國HealForce公司），倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司，型號：TS100 Nikon），超凈臺（中國蘇州楓橋凈化設備有限公司），細胞培養盒、96孔細胞培養板（美國Coming），酶標儀（美國molecular device公司，型號：Spectra Max 190）。HepG2.2.15細胞：南京大學徐力致老師惠贈。藥物空心蓮子草于2013年11月采集于江蘇省鎮江市丹徒區西麓鎮，經中國藥科大學黃達芳副教授鑒定為空心蓮子草 A. philoxeroides（Mart.）Griseb.。從空心蓮子草中提取分離出總黃酮（經南京中醫藥大學藥學院江蘇省中藥炮制重點實驗室波譜解析確定其主要成分為黃酮類化合物）。拉米夫定（中國蘇州葛蘭素史克制藥有限公司，批號：16120014）

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 ①供試藥制備。空心蓮子草粗粉300 g，采用回流提取法，分別以藥材量12、10、10倍量60%乙醇溶液提取3次，每次提取1 h，過濾合并濾液，減壓回收溶劑至無醇味。使用D101樹脂精制，上樣液濃度為6 mg/mL，上樣量100 mg/g干樹脂，以50 g/L NaHCO3調節pH值至6，上樣液流速2 mL/min，吸附1 h。先用提取物量5倍體積水洗脫，再用10倍體積70%乙醇溶液洗脫，洗脫流速3 mL/min。收集70%乙醇溶液洗脫液，減壓回收至無醇味，經波譜解析確定結構，即得空心蓮子草總黃酮。②藥物配制?？招纳徸硬菘傸S酮和拉米夫定分別用1000 mL/L二甲基亞砜（DMSO）溶解，配制成160 mg/L濃度，再以50 g/L NaHCO3調節pH值至6.8～7.2，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌備用。

1.2.2 HepG2.2.15細胞系的培養體系 在DMEM中加入150 mg/L胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，380 mg/L G418，10 mL/L鏈霉素、青霉素，以50 g/L NaHCO3調節pH值至7.2～7.4培養，每10天傳代一次。

1.2.3 空心蓮子草總黃酮細胞毒性試驗 將HepG2.2.15細胞按1×108/L接種于細胞培養板，然后隨機分成陰性對照組、實驗組和陽性對照組，分別在陰性對照組中加入100 mL/L DMSO；實驗組各組中加入800、400、200、100 mg/L濃度的空心蓮子草總黃酮，陽性對照組各組中加入800、400、200、100 mg/L濃度的拉米夫定共培養。參照文獻[7，8]，在其規定條件下培養、吸去上清液、固定細胞、洗滌、抽取測試所需細胞上清液，用自動酶標儀于在吸收波長 515 nm條件下，測定該細胞上清液吸光度（A）。

1.2.4 空心蓮子草總黃酮對HepG2.2.15細胞系HBsAg與HBeAg表達的影響 參照文獻[7-8]，按其方法接種和培養HepG2.2.15細胞，然后以800、400、200、100 mg/L的藥物濃度將實驗組和陽性對照組各組份加入細胞板中，每個濃度設2個孔，設100 mL/L DMSO組8孔為陰性對照組，分別于第3、6、9天取培養基上清液于-200℃凍存，測定A值，計算藥物對HBsAg、HBeAg分泌的抑制率（%）[抑制率（%）=（對照組吸光度值-給藥組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%]、50%抑制濃度（IC50）、治療指數（TI=CD50/IC50）。當TI>2時為有效，TI=1時為毒性作用較強，TI<1時為毒性作用強。

1.3 統計學方法

應用SPSS 11.5統計學軟件進行統計處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗。以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 空心蓮子草總黃酮對 HepG2.2.15細胞系 HBsAg表達的抑制作用

應用 HepG2.2.15細胞系培養系統實驗證明：實驗組中各劑量組對HBsAg的抑制率均有明顯的升高（表1）。實驗組與陰性對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.01）；實驗組與陽性對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）；實驗組中HBsAg的抑制率跟藥物劑量呈正相關。表明空心蓮子草總黃酮對對HepG2.2.15細胞中HBsAg表達有明顯的抑制作用。endprint

2.2 空心蓮子草總黃酮對 HepG2.2.15細胞系 HBeAg表達的抑制作用

應用HepG2.2.15細胞系培養系統實驗證明：實驗組各劑量組對HBeAg的抑制率均有明顯的升高。實驗組與陰性對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.01）；實驗組與陽性對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）；實驗組中HBeAg抑制率跟藥物劑量呈正相關（表2）。表明空心蓮子草總黃酮對對HepG2.2.15細胞中HBeAg表達有明顯的抑制作用。

3 討論

本實驗從空心蓮子草中提取分離出空心蓮子草總黃酮，研究發現其對HBsAg和HBeAg表達均有明顯的抑制作用（HBsAg和HBeAg的抑制率，實驗組與陰性對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.01）；實驗組與陽性對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）；實驗組中HBsAg和HBeAg的抑制率跟藥物劑量均呈正相關），從細胞藥理學研究水平上證實空心蓮子草總黃酮具有較強的體外抗HBV活性。本實驗也發現，空心蓮子草總皂苷對HBsAg和HBeAg表達均有明顯的抑制作用（與陰性對照組比較，P < 0.01；與陽性對照組比較，P < 0.05），同時采用定量PCR方法檢測，空心蓮子草總皂苷（200 mg/L）可使培養基中HBV-DNA轉陰。

曾有學者從從空心蓮子草中分離鑒定了10個三萜皂苷類化合物，抗HBV活性篩選表明，齊墩果酸（oleanolic acid）和4，5-dihydroblumenol 具有較強的抗HBV活性[4，9]。近年來，對空心蓮子草抗病毒的藥效物質基礎進行了研究，確定了其有效物質部位主要為黃酮和皂苷類化合物[10-12]。以上表明空心蓮子草對乙肝病毒具有較好的體外抑制作用。

既往研究表明，空心蓮子草對呼吸道合胞病毒、甲型H3N2流感病毒等病毒均有抑制作用[13-15]。提示空心蓮子草是具有較好開發應用前景的抗病毒中草藥。空心蓮子草曾以注射劑收錄于中國藥典（一部，1977年版），用于治療麻疹、流行性出血熱、病毒性肝炎等病毒性感染。但其抗乙肝病毒作用的藥效學作用及物質基礎并不十分明確，尤其其抗乙肝病毒作用分子細胞藥理學的研究比較欠缺。

乙型肝炎由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的慢性傳染性疾病。全球共有20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性HBV 感染者，每年約有78.6萬人死于慢性HBV感染相關肝病。盡管乙型肝炎疫苗接種已使我國新發感染者得到明顯控制，但我國仍有慢性HBV感染者約8000萬例，其中慢性乙型肝炎患者高達2000余萬例[16]。臨床統計資料顯示，在慢性HBV感染者中，15%～25%最終死于與HBV感染相關的肝衰竭、肝硬化和原發性肝細胞癌（hepatocellular carci?noma，HCC），其中慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）、代償期和失代償期肝硬化患者的5年病死率分別為0～2%、14%～20%和70%～86%[17]，嚴重危害人類健康，必須盡快接受規范的抗乙肝病毒治療。僅十多年來，盡管隨著核苷類乙肝抗病毒藥物拉米夫定、阿德福韋酯、替比夫定、恩替卡韋、替諾福韋等不斷上市，對乙肝病毒有較好的抑制作用，但停藥后乙肝病毒變異或復發以及徹底從體內清除乙肝病毒如HBV-cccDNA模板非常困難等諸多問題，仍然一直困擾著醫藥學研究工作者。因此尋找安全有效的抗HBV藥物是醫藥學工作者必須攻克一項醫學難題。

HepG2.2.15細胞是人肝癌細胞系HepG2細胞衍生，經HBV-DNA克隆和轉染的人肝癌細胞HepG2.2.15細胞系，能轉錄、翻譯HBV基因，且其能較為穩定、持久地向培養上清液中分泌HBsAg、HBeAg和HBV顆粒，細胞上清液中也可以測得到HBV-DNA。故HepG2.2.15細胞系便于應用熒光定量檢測儀檢測HBsAg、HBeAg和HBV DNA，并對人有感染性，故是目前體外公認的抗HBV藥物體外高通量篩選和評價較好的細胞模型之一[18-21]。

為了闡明空心蓮子草治療慢性乙肝的理論依據，今后尚需進一步從化合物單體水平證明空心蓮子草所含其他有效成分的抗HBV活性，并需對其進行體內抗HBV活性及機制的深入探討，然后在充分臨床前研究基礎上進行多中心隨機對照的藥物臨床試驗，爭取開發出用于臨床乙肝抗病毒治療的天然藥物。

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（收稿日期：2017-09-11 本文編輯：李雅南）endprint