AMH及其相關基因在鴨不同等級卵泡中的表達

陳 蓉， 應詩家， 陳 哲， 于建寧， 施振旦

(江蘇省農業科學院畜牧研究所，江蘇 南京 210014)

抗繆勒氏管激素(Anti-Mullerian hormone，AMH)，又稱繆勒氏管抑制物質(Mullerian-inhibiting substance，MIS)，是轉化生長因子β(transforming growth factorβ，TGFβ)超家族成員[1]，在性腺組織中表達。最初，人們對AMH的理解僅限于其在性別分化中的作用——抑制雄性胚胎繆勒氏管的發育[2]。直到1999年，Durlinger等通過AMH基因敲除小鼠研究發現AMH具有抑制原始卵泡募集和降低生長卵泡對促卵泡激素(Follicle-stimulating hormone，FSH)敏感性的作用[3-4]。體外研究結果已表明，AMH抑制生長卵泡對FSH敏感性是通過調控FSH受體(FSH receptor，FSHR)信號通路實現的[5-6]。與其他TGFβ超家族成員一樣，AMH通過與細胞膜上的2個絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(Ⅰ和Ⅱ型)相結合，激活胞漿內Smad分子從而調控靶基因的轉錄[7]。其中，Ⅱ型受體(AMH receptor 2，AMHR2)是AMH特異性的[8]，Ⅰ型受體則與TGFβ超家族另一個成員骨形態發生蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)共享[9]。與哺乳動物相比，AMH基因在禽類卵泡發育中的功能研究起步較晚，目前主要集中在家雞中。2008年，Johnson等[10]首次檢測了產蛋雞卵巢不同等級卵泡的顆粒細胞中AMH基因的表達情況，發現AMH基因的信使核糖核酸(Messenger ribonucleic acid，mRNA)表達量隨著卵泡的發育逐漸降低，并且AMH主要由小卵泡的顆粒細胞表達，與哺乳動物的表達模式相一致，表明AMH基因在禽類中具有保守的生物學功能。目前，國內外尚無AMH基因在水禽卵泡發育中的功能研究。本研究擬以連城白鴨為研究對象，通過定量PCR技術檢測卵巢不同等級卵泡中AMH基因及其相關調控基因的表達情況，為水禽卵泡發育的分子機制研究積累基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

選擇同批出雛同條件飼養的200日齡連城白鴨雌性個體8只，分別采集卵巢組織中的等級卵泡F5(最小的等級卵泡)、小黃卵泡(Small yellow follicle，SYF)和大白卵泡(Large white follicle，LWF)，經液氮速凍后置于-80 ℃保存。其中，等級卵泡F5去除卵黃蛋白。

1.2 總RNA提取與cDNA第一鏈的合成

采用動物組織總RNA提取試劑盒[DP431，天根生化科技(北京)有限公司產品]提取總RNA，NanoDrop 2000分光光度計檢測RNA的純度(OD260/OD280≥1.8；OD260/OD230≥1.0)和濃度。采用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒[RR036A，日醫生物技術(北京)有限公司產品]以總RNA為模板合成互補脫氧核糖核酸(Complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)第一鏈。

1.3 mRNA定量PCR分析

根據GenBank中綠頭鴨或者近緣物種相關mRNA序列設計基因特異性引物，引物信息見表1，其中SF1(Steroidogenic factor 1，類固醇生成因子1)、WT1(Wilms tumor 1，Wilms腫瘤基因1)、GATA4(GATA-binding protein 4，GATA結合蛋白4)基因引物序列引自參考文獻[11]。以β-肌動蛋白(β-actin)為內參基因，按照TransStart Top GreenSuperMix試劑盒(AQ131-04，北京全式金生物技術有限公司產品)的說明書配制反應體系并在ABI 7500 Real-Time PCR儀上進行聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)，每個樣品重復3次。

表1定量PCR引物信息表

Table1PrimersinformationforquantitativePCR

基因名稱 序列(5'→3')產物長度(bp)退火溫度(℃)AMHF:CTCGGATGACAAATGCTTCA11160R:ACTCCATCAGCGGAGAGGTASOX9F:GCTGAATGAGAGCGAGAAGC11960R:CGTTCTTCACCGACTTCCTCSF1F:GCTCAGTACCTTTGGCCTCA12260R:GCAGCAGCTTCATCTGGTCTGATA4F:TTTCTGCTAACGGGAGGGAGCAAT10260R:AAGTCCAAGTGGTGGCCATTTCAGWT1F:TCTGAAGACTCATACCAGGACTCA13660R:CATGTTCCTCTGGTGCATGTAMHR2F:CTGATGGAGCACGAGAACG9060R:GTAGAGCTGCAGGACCAGGAFSHRF:CCTAGCCATTGCTGTGCATTT10660R:TGCCAGGTTGCTCATCAAGGCYP19A1F:AGAAGCGACAACAGCTTTCC12660R:TCTCCAGCACACACTGGTTCβ-actinF:GAGAAATTGTGCGTGACATCA15260R:CCTGAACCTCTCATTGCCA

1.4 總蛋白提取

將卵泡組織置于適量的組織細胞裂解液(WB-0061，北京鼎國昌盛生物技術有限公司產品)中，勻漿，冰上靜置至充分裂解，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，保留上清液，BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白的濃度(BCA01，北京鼎國昌盛生物技術有限公司)。取適量的上清液與蛋白上樣緩沖液混勻，煮沸5 min，冷卻至室溫。

1.5 蛋白質印跡檢測

總蛋白質經濃度為12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離后，電轉印至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride，PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入鼠抗人AMH單克隆抗體(稀釋比例為1∶100，sc-166752，Santa Cruz公司產品)，4 ℃孵育過夜。洗膜緩沖液(Tris-buffered saline with 0.05% Tween 20，TBST)洗滌后，加入過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG(稀釋比例為1∶2 000，CW0103S，北京康為世紀生物科技有限公司產品)，室溫孵育1 h。TBST洗滌后，加入EasySee? Western Blot Kit發光液(DW101-02，北京全式金生物技術有限公司產品)，置于ImageQuant LAS 4000化學發光成像儀中曝光，拍照。同時，使用兔抗人β-actin單克隆抗體(稀釋比例為1∶1 000，Cat No. 4970，Cell Signaling Technology公司產品)進行內參蛋白的檢測。

1.6 數據分析

采用2-△△Ct法進行mRNA定量PCR試驗數據處理，目的基因的相對表達量采用“平均數±標準差”的形式表示。采用Image J軟件對蛋白質印跡條帶進行灰度值分析，目的蛋白的相對表達水平采用“平均數±標準差”的形式表示。采用SPSS軟件進行統計分析，均值比較采用單因素方差分析法，兩兩比較采用LSD法。

2 結果與分析

2.1 AMH基因在鴨不同等級卵泡中的表達量

本研究分別通過定量PCR和蛋白質印跡技術檢測了AMH基因在鴨不同等級卵泡中的表達情況。在mRNA水平上，AMH基因在大白卵泡中的表達量顯著高于等級卵泡F5，在小黃卵泡中的表達量也顯著高于等級卵泡F5(圖1A)。在蛋白質水平上，AMH蛋白在大白卵泡中的表達量顯著高于小黃卵泡和等級卵泡F5，但是在小黃卵泡中的表達量與等級卵泡F5無顯著差異(圖1B)。此外，AMH基因在蛋白質水平上的差異程度要低于mRNA水平。這些結果表明，隨著卵泡的發育，AMH基因的表達量逐漸降低。

A：AMH基因的mRNA表達量；B：AMH蛋白的表達量。F5：等級卵泡F5；SYF：小黃卵泡；LWF：大白卵泡。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖1 鴨不同等級卵泡中AMH基因的表達量Fig.1 Expression of AMH gene in various-sized follicles of duck

2.2 AMH基因啟動子區相關轉錄因子在鴨不同等級卵泡中的表達量

本研究通過定量PCR技術分別檢測了SOX9(Sex determining region Y-box 9，SRY相關基因9)、SF1、GATA4和WT1這4種轉錄因子在鴨卵巢不同等級卵泡中的表達量。在mRNA水平上，SOX9基因在不同等級卵泡中的表達量無顯著差異(圖2A);SF1和GATA4基因在大白卵泡和小黃卵泡中的表達量顯著高于等級卵泡F5(圖2B和圖2C)；WT1基因在大白卵泡和小黃卵泡中的表達量也顯著高于等級卵泡F5(圖2D)。這些結果表明，隨著卵泡的發育，SF1、GATA4和WT1基因的表達量逐漸降低。

A～D：分別為SOX9、SF1、GATA4和WT1基因的mRNA表達量。F5：等級卵泡F5；SYF：小黃卵泡；LWF：大白卵泡。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2 鴨不同等級卵泡中轉錄因子SOX9、SF1、GATA4和WT1的表達量Fig.2 Expression of SOX9, SF1, GATA4 and WT1 in various-sized follicles of duck

2.3 AMHR2和AMH相關調控基因在鴨不同等級卵泡中的表達量

本研究通過定量PCR技術分別檢測了AMHR2、FSHR、CYP19A1和BMP6這4種基因在鴨卵巢不同等級卵泡中的表達量。在mRNA水平上，AMHR2基因在小黃卵泡的表達量顯著高于等級卵泡F5(圖3A)；FSHR基因在不同等級卵泡中的表達量無顯著差異(圖3B)；CYP19A1基因在小黃卵泡和等級卵泡F5中的表達量顯著高于大白卵泡(圖3C)；BMP6基因在大白卵泡和小黃卵泡中的表達量顯著高于等級卵泡F5(圖3D)。這些結果表明，隨著卵泡的發育，CYP19A1基因的表達量逐漸升高，AMHR2和BMP6基因的表達量逐漸降低。

3 討 論

鑒于AMH基因在哺乳動物和雞卵泡發育中的重要作用，本研究通過定量PCR技術檢測了鴨卵巢不同等級卵泡中AMH基因的表達情況。結果發現AMH基因的mRNA表達量隨著卵泡的發育逐漸降低，這與Johnson等在產蛋雞中的研究結果相一致[10]，表明AMH基因在禽類中具有保守的生物學功能。鑒于哺乳動物AMH抗體可用于檢測禽類AMH蛋白表達[12]，本研究還從蛋白質水平上驗證了AMH基因在卵泡發育中的表達規律。在哺乳動物中，AMH基因的起始轉錄需要轉錄因子SOX9的參與，而轉錄因子SF1、WT1和GATA4能夠協同SOX9增強AMH基因的表達[13]。但是，Oreal等[14]在雞胚中發現AMH基因的起始轉錄不需要轉錄因子SOX9的參與，表明AMH基因轉錄的調控機制在禽類與哺乳動物之間是非保守的。本研究通過定量PCR技術分別檢測了這4種轉錄因子在鴨卵巢不同等級卵泡中的表達情況。結果發現，除了SOX9基因外，SF1、WT1和GATA4基因的mRNA表達量隨著卵泡的發育逐漸降低，與AMH基因的表達趨勢相一致，表明這3種轉錄因子可能在AMH轉錄調控中發揮重要作用。其中，Takada等[15]在雞胚中已經證實SF1能夠結合到AMH基因啟動子區并激活其轉錄。因此，下一步我們需要證實WT1和GATA4是否能夠結合到禽類AMH基因啟動子區并激活其轉錄。

A～D：分別為AMHR2、FSHR、CYP19A1和BMP6基因的mRNA表達量。F5：等級卵泡F5；SYF：小黃卵泡；LWF：大白卵泡。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3 鴨不同等級卵泡中AMHR2、FSHR、CYP19A1和BMP6基因的表達量Fig.3 Expression of AMHR2, FSHR, CYP19A1 and BMP6 genes in various-sized follicles of duck

在哺乳動物中的研究結果表明，AMH抑制生長卵泡對FSH敏感性是通過調控FSHR信號通路實現的。因此，本研究通過定量PCR技術分別檢測了AMHR2、FSHR和CYP19A1基因的表達情況。結果發現，AMHR2基因的mRNA表達量在等級卵泡中顯著降低，與AMH基因的表達趨勢相似，推測AMH在卵泡發育中的重要作用是由其受體AMHR2介導的。盡管FSHR基因的表達量在不同等級卵泡間無顯著差異，但是CYP19A1基因的表達量隨著卵泡的發育逐漸升高，與AMH基因的表達趨勢相反，推測AMH基因具有抑制FSHR信號通路的功能，而且這種作用是通過影響FSHR信號通路的下游因子來調控類固醇激素的合成實現的。在雞中，Ocón-grove等[11]發現BMP6和AMH基因在卵泡發育中具有相似的表達模式，并且BMP6能以劑量依賴關系促進雞等級前卵泡顆粒細胞中AMH基因的表達，表明AMH基因的表達受到卵巢局部生長因子的調控。在本研究中，我們也發現BMP6和AMH基因在鴨不同等級卵泡中的表達趨勢一致，但是BMP6是否能夠促進AMH基因的表達需要進一步的試驗驗證。

綜上所述，AMH基因在鴨卵泡發育過程中發揮重要作用，其在等級前卵泡中的高表達量可能有助于維持顆粒細胞未分化的狀態，且可能是通過抑制FSHR信號通路來實現的。

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