豬流行性腹瀉病毒HB2015分離株N基因表達及單克隆抗體的制備

祁光宇， 劉 斌， 趙興緒

(1.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅 蘭州 730070； 2.中農威特生物科技股份有限公司，甘肅 蘭州 730046)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種急性、高度傳播性的豬特別是仔豬腸道疾病，以豬急性腸炎、水樣腹瀉、嘔吐和嚴重脫水為主要特征[1-2]。中國在2010年PEDV出現新的變異株[3]。這些新變異株造成較高的新生仔豬和哺乳豬發病率和死亡率[4]。PEDV感染不但給養豬業造成巨大經濟損失，并且導致國內豬肉價格上漲。

PEDV 基因組為單股正鏈 RNA，整個基因組長約為 28 Kb，編碼的必須結構蛋白質有4種，分別為突蛋白(S)、小膜蛋白(sM)、膜蛋白(M)和核蛋白(N)[5-6]。PEDV的核心部分是N蛋白與基因組RNA結合形成的螺旋狀核蛋白體。N蛋白是PEDV已知結構蛋白中唯一的磷酸化蛋白，也是組成病毒核衣殼的結構基礎。除此之外，N蛋白還具有保守性強的特點，而豬在感染PEDV的早期，體內就能產生高水平的抗N蛋白抗體。因而利用N蛋白建立PEDV分子生物學診斷技術具有很好的應用前景[7]。豬流行性腹瀉與豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒病和細菌性腹瀉等從臨床癥狀上很難區分[8]，必須進行實驗室檢測才能確診。目前，檢測豬流行性腹瀉病毒的主要方法有反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、抗原酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫組化等[9-10]，這些方法費時費力，所以快速、準確的實驗室診斷方法對于豬流行性腹瀉的監測和防控具有重要意義。本研究以原核表達的N蛋白為基礎制備單克隆抗體，以期為進一步研制豬流行性腹瀉病快速診斷方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和主要試劑

豬流行性腹瀉病毒B2015株由中農威特研發中心分離保存。載體pET-32a(+)由本實驗室保存。T-Vector pMDTM19 (Simple)、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、TaKaRa Ex Taq?試劑盒、限制性內切酶為寶日醫生物技術有限公司產品，One Step RT-PCR Kit、Gel Extraction Kit D2500瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑、Viral RNA Kit為OMEGA公司產品，克隆DH5α感受態細胞、表達BL21(DE3) 感受態細胞、HRP標記的羊抗鼠IgG、FITC標記的羊抗鼠IgG、DMEM培養基、胎牛血清為全式金公司產品，His-trap HP型鎳離子親和層析柱為GE公司產品。其他常規試劑為國產分析純。

1.2 引物設計與合成

根據國內近幾年豬流行性腹瀉病毒株，參考GenBank中KX016034.1全基因組序列設計1對特異引物擴增N基因。根據載體酶切位點的要求，引物分別加入BamH Ⅰ和XhoⅠ位點，引物NF序列為5′-AACGGATCCATGGCTTCTGTCAGTTTTCA-3′，，NR為5′-AGACTCGAGTTAATTTCCTGTATCGAAG-3′。引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.3 病毒總RNA提取與One Step RT-PCR擴增

按照Viral RNA Kit試劑盒說明書提取豬流行性腹瀉病毒B2015株的基因組RNA。以提取的RNA為模板，采用RT-PCR擴增N基因。反應體系: 5×Reaction buffer 10 μl，Template RNA 10 μl，Sense primer (10 μmol/L) 1 μl，Anti-sense primer (10 μmol/L) 1 μl，M-MLV RTase/TaqDNA Polymerase Mix 1 μl，Nuclease-free water 271 μl。反應程序：42 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環,最后72 ℃延伸5 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳產物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行純化。

1.4 表達載體的構建與鑒定

將回收產物連接至T-Vector pMDTM19 (Simple)載體上，并轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，37 ℃過夜培養后挑取單菌落接種至含100 μg/ml 氨芐青霉素(Amp+)的LB液體培養基中增殖培養，提取重組質粒進行鑒定和測序。將測序正確的重組質粒pMDTM19-N和質粒pET32a(+)用BamHⅠ和XhoⅠ兩種內切酶進行酶切，對兩種酶切產物進行切膠回收后，使用T4 DNA ligase分別連接同樣經酶切后的質粒pET32a(+)和質粒pMDTM19-N，16 ℃連接過夜。將連接后的產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，并涂布于Amp+LB固體培養基平板中，培養板倒置于37 ℃培養箱中過夜培養。挑取單菌落至Amp+LB液體培養基中增殖培養，提取質粒進行酶切和PCR鑒定、測序。質粒測序由寶日醫生物技術有限公司進行。

1.5 重組N蛋白的表達、鑒定及純化

將測序正確的重組質粒pET32a-N轉化至大腸桿菌BL21(DE3) Chemically Competent Cell感受態細胞，并涂布于Amp+LB平板中，挑取單菌落至Amp+LB液體培養基中培養活化，加入終濃度為1 mmol/L IPTG在37 ℃條件下誘導表達5 h。將不同時間收集的菌液12 000 r/min離心5 min，棄上清。沉淀用50 μl PBS重懸后加等量的2×SDS凝膠上樣緩沖液，沸水煮10 min后進行SDS-PAGE電泳檢測。

1.6 表達蛋白純化及動物免疫

將大量表達的細菌沉淀用Binding Buffer重懸并用超聲波裂解菌體，離心取上清部分，參照His-trap HP型鎳離子親和層析柱說明書純化蛋白質。將所得蛋白質免疫6周齡BALB/c小鼠，同時做空白對照，在融合前3 d每只小鼠腹腔注射200 μg進行加強免疫。

1.7 PEDV-N蛋白單抗的制備

小鼠尾靜脈取血，用ELISA方法測定各小鼠血清效價，效價高于1∶10 000的鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按聚乙二醇(PEG)方法進行雜交融合。用間接ELISA對雜交瘤細胞上清液進行篩選，陽性孔再經過3次有限稀釋法進行亞克隆[11]，待陽性率達到100%時擴大培養，用于制備腹水，并保存于液氮。參照文獻[12]制備腹水，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，離心取上清液。

1.8 單克隆抗體Western blot檢測

將PEDV感染的細胞用細胞裂解液和SDS處理，進行SDS-PAGE試驗，轉PVDF膜后封閉。以制備的單克隆抗體反應1 h, TBST洗滌后加入HRP標記羊抗鼠IgG反應1 h, TBST洗滌后顯色進行鑒定。同時設立空質粒表達的菌體蛋白為陰性對照組。

1.9 單克隆抗體的間接免疫熒光試驗(IFA)檢測

用PEDV感染接種于24孔細胞板的Vero細胞。培養至出現明顯病變時，先用甲醛固定細胞，PBS洗滌之后加入PBSA封閉1 h。PBS洗滌后加入制備的單克隆抗體反應1 h，PBS洗滌干凈，并加入綠色熒光二抗反應1 h，洗滌干凈后進行熒光觀察。同時設未感染的細胞作空白對照。

2 結 果

2.1 PEDV N基因重組表達質粒pET-32a-N的鑒定

對重組質粒pET-32a-N進行BamH I、XhoI雙酶切和PCR后進行電泳，分別在約6 000 bp和1 326 bp處出現明亮的條帶，與預期大小一致(圖1)。測序結果顯示與標準基因同源性為100%，說明已成功構建了豬流行性腹瀉病毒N基因原核表達載體pET-32a-N。

M：DNA標準DL 8000；1：重組表達質粒pET-32a-N對照；2：pET-32a-N的Bam H I、Xho I雙酶切；3：N基因的PCR產物。圖1 豬流行性腹瀉病毒N基因重組表達質粒pET-32a-N的鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pET-32a-N of porcine epidemic diarrhea virus N gene

2.2 重組N蛋白的誘導表達和純化

含有重組質粒的E.coliBL21(DE3)經IPTG誘導表達后，SDS-PAGE電泳分析結果顯示有1條分子量約為 6.8×104大小的蛋白質條帶，與預期大小一致，說明重組質粒在大腸桿菌中成功表達(圖2)。將純化后的蛋白質經SDS-PAGE電泳后，轉印到NC膜上，用豬流行性腹瀉陽性血清進行Western blotting鑒定。結果顯示，在分子量約 6.8×104處可見特異性條帶，而菌體蛋白無條帶(圖3)。

M：蛋白質分子質量標準；1：誘導后的pET-32a(+)空載體；2：未誘導的pET-32a-N/E.coli BL21(DE3)重組菌；3：誘導后的pET-32a-N/E.coli BL21(DE3)重組菌。圖2 重組N蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant N protein

M：蛋白質分子質量標準；1：純化N蛋白。圖3 純化的重組N蛋白Western blotting分析Fig.3 Western blotting analysis of purified recombinant N protein

2.3 陽性雜交瘤細胞的篩選

用ELISA方法篩選得到穩定的陽性雜交瘤細胞。將初步篩選出的陽性雜交瘤細胞再經3次亞克隆，共獲得2株穩定分泌抗N蛋白的雜交瘤細胞株，分別命名為C5D3和H3E7,將其擴大培養后保存于液氮備用。

2.4 單克隆抗體C5D3和H3E7的Western blotting鑒定

2株單抗C5D3和H3E7均可特異性識別N蛋白，在分子量約 6.8×104處出現特異性條帶，而與空質粒表達的菌體蛋白不發生反應(圖4)。

M：蛋白質分子質量標準；1：C5D3株；2：H3E7株；3：陰性對照。圖4 單抗C5D3和H3E7株的Western blotting分析Fig.4 Western blotting analysis of monoclonal antibody of C5D3 and H3E7

2.5 單克隆抗體C5D3和H3E7的IFA分析

IFA檢測結果顯示，感染PEDV病毒的細胞出現明顯綠色熒光，而對照組無熒光出現(圖5)，證明這2個單抗能特異地識別和結合PEDV病毒N蛋白。

3 討 論

中國近幾年PED的發病率、死亡率均呈明顯上升趨勢，特別是從2010年10月以后，PED在中國廣泛流行并出現新的變異株。感染 PEDV后，哺乳仔豬死亡率可達80%～100%，但繁殖母豬和公豬感染后很少表現出臨床癥狀。PED大規模暴發的最主要原因是病毒的變異，這給PED的防控帶來了新的挑戰[13]。

在PEDV合成過程中，N蛋白既能與病毒RNA纏繞成為病毒粒子的核衣殼，又能結合磷脂和細胞膜，促進形成RNA復合體，對病毒組裝有重要作用[5-6]。同時N蛋白的保守性很高，在豬感染早期，機體就可以產生抗N蛋白抗體，所以N蛋白可以作為早期診斷的靶蛋白，同時可以用于研制開發抗PEDV的表位疫苗[14]。

本試驗通過構建PEDVN基因重組質粒pET-30a-N，然后以純化后的PEDV-N蛋白為免疫原免疫小鼠，成功制備了2株抗PEDV的單克隆抗體。經ELISA和IFA方法檢驗，制備的單抗均能與PEDV N蛋白和PEDV結合。在試驗過程中，發現對雜交瘤細胞系定期克隆化檢測抗體水平是很有必要的，其目的是防止雜交瘤細胞在長期傳代過程中喪失分泌抗體的功能，影響后續試驗的進行。對雜交瘤細胞穩定性分析結果顯示，2株單抗分泌能力穩定性良好，未出現急性下降甚至消失的情況。在制備腹水過程中發現，C5D3株單抗細胞產生腹水量很少，H3E7株細胞產生的腹水量比較多。其中腹水量少的原因：一是于注射石蠟后7 d就注射細胞，時間過早；二是細胞量過多也會引起腹水過少或不出現，出現實體瘤現象[14]。

A：C5D3株；B：H3E7株；C：陰性對照。 圖5 單克隆抗體C5D3和H3E7與感染PEDV的Vero 細胞IFA 試驗Fig.5 The indirect immunofluorescence assay (IFA) of PEDV in Vero cells with monoclonal antibody of C5D3 and H3E7

快速、準確以及操作簡單易行的診斷方法是有效防控疫病的基礎和前提條件。近年來在PED診斷方法上取得了很大進展，目前已經有很多新技術應用于PED的診斷,比如ELISA、RT-PCR和免疫熒光技術[15]。雖然這些檢測方法準確率較高，但所需試劑繁多、經濟成本高，且有設備和技術要求，難以在基層推廣普及[16]。膠體金免疫層析法(GICA)是近些年發展起來的一種以抗原抗體特異性反應為基礎的新型免疫檢測技術，可以彌補儀器檢測方法的不足，在現場檢測方面具有廣闊的應用前景[17]。本試驗成功制備并鑒定了抗PEDV-N蛋白單克隆抗體，為豬流行性腹瀉病毒金標試紙檢測方法的建立奠定了堅實基礎。

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